胚胎干细胞的基因编辑方法与流程

本技术一般涉及通过基因编辑改善牛、猪、绵羊或水生生物体的性状或适应性(fitness)的方法。特别地，这些方法包括修饰牛、猪、绵羊或水生生物体的胚胎干细胞中的基因，以达到改善性状(例如，促进病原体抗性、生育力、泌乳和支持更快速生长或饲料效率的天然性状)的目的。

背景技术：

0、背景

1、以下对本技术背景的描述仅仅是为了帮助理解本技术而提供的，并不意味着描述或构成本技术的现有技术。

2、在家猪和其他牲畜物种中，产生遗传改造动物的常规方法是体细胞核转移(scnt)或克隆，其中体细胞(通常是胎儿成纤维细胞)经过修饰以引入预期的遗传修饰，然后用作scnt的核供体。然而，体细胞基因靶向的效率通常较低，而且需要费时费力的筛选过程。正确的重组事件很少见(1/106-107个细胞)，通常是单等位基因，并且需要第二轮靶向以产生纯合/双等位基因修饰。

3、将crispr试剂直接显微注射到胚胎中是培育遗传修饰的活后代的直接且首选的选择。普遍的共识是，早期受精卵的基因组处于开放构象，且因此非常适合相对容易地靶向大多数基因座。也就是说，显微注射受精卵的使用也有局限性，其中最主要的是需要大量供体动物来获取体内来源的胚胎以便进行胚胎移植、嵌合性要求高以及在生成研究所需的一组编辑动物方面的效率不可预测。需要更有效的crispr编辑方法。

4、本技术概述

5、在一方面，本公开提供了用于改善非人动物受试者(如牛、猪、绵羊或水生生物体)的性状的方法，其包括：(a)将从牛、猪或水生生物中获得的胚胎干细胞与有效量的基因编辑试剂接触，以获得包含目的靶基因中的修饰的遗传修饰的胚胎干细胞，其中基因编辑试剂被配置为修饰目的靶基因；(b)将遗传修饰的胚胎干细胞的细胞核移植或注射到去核卵母细胞中，以获得包含目的靶基因中的修饰的卵母细胞；以及(c)从包含目的靶基因中修饰的卵母细胞建立胚胎。

6、在一些实施方案中，胚胎干细胞获自牛，并且该方法还包括将胚胎植入母牛或小母牛受体中，并使胚胎发育成具有改良性状的胎仔。在某些实施方案中，胚胎干细胞获自猪，并且该方法还包括将胚胎植入小母猪或母猪受体中，并使胚胎发育成具有改良性状的胎仔。在本文所公开方法的任何前述实施方案中，胚胎干细胞是从胚泡期胚胎的内细胞团(icm)中分离出来的。胚泡期胚胎可以通过体外受精获得。在一些实施方案中，在分离胚胎干细胞之前，在细胞培养基中体外培养胚泡期胚胎。另外或另选地，在某些实施方案中，胚胎干细胞表达一种或更多种基因，包括但不限于dusp6、zic3、dnmt3a/b zic2、otx2、tet1、ncam1、tet3、myc、cd47、hoxa1、foxa2、gata6、tbx3、oct4、cdx2和sox2。在本文所公开方法的任何前述实施方案中，细胞培养基可以包含：(ⅰ)灭活的饲养细胞；(ⅱ)有效量的成纤维细胞生长因子2(fgf2)；和(ⅲ)有效量的一种或更多种wnt信号传导抑制剂。另外或另选地，在本文所公开方法的一些实施方案中，在步骤(a)或步骤(b)之前，在细胞培养基中体外培养胚胎干细胞。

7、在其他实施方案中，胚胎干细胞是鱼胚胎干细胞，并且该方法还包括在适于培养鱼类的条件下培养胚胎直至孵化。在一些实施方案中，鱼胚胎干细胞是通过采用饲养层或无饲养层培养条件从囊胚期胚胎中获得的。囊胚期胚胎可以通过外部或体外受精获得。饲养层细胞的实例包括斑马鱼胚胎成纤维细胞、水牛、大鼠肝细胞和虹鳟鱼脾细胞系rts34st。在无饲养层培养系统中，有益es细胞培养基的组分可以包括来自青鳉鱼的鱼胚胎提取物、碱性成纤维细胞生长因子和鱼血清，它们能够支持分离的囊胚期胚胎(mbe)细胞在明胶包被培养皿上的自我更新。另外或另选地，在某些实施方案中，鱼胚胎干细胞表达oct4、nanog、klf4、sox2、myc、ronin、sall4和tcf3(tcf7l1)中的一种或更多种。另外或另选地，在本文所公开方法的一些实施方案中，在步骤(a)或步骤(b)之前，在细胞培养基中体外培养鱼胚胎干细胞。另外或另选地，在本文所公开方法的一些实施方案中，胚胎干细胞可以来自除鱼以外的水生生物，包括虾和其他甲壳类动物以及软体动物(例如，腹足类、头足类和双壳类)。

8、示例性性状包括但不限于高海拔适应和对缺氧的反应、冷适应、体型和身材、对疾病和细菌感染的抵抗力、繁殖以及生长和饲料效率。特别地，示例性牛性状包括但不限于高海拔适应和对缺氧的反应、冷适应、体型和身材、对疾病和细菌感染的抵抗力、奶的产量和成分、生长和饲料效率或无角表型。在这些方法的一些实施方案中，目的靶基因中的修饰是敲入、敲除、缺失或点突变。另外或另选地，在一些实施方案中，目的靶基因中的修饰包括最多200个核苷酸的修饰。

9、另外或另选地，在一些实施方案中，目的靶基因是anp32、anpep、tmprss1、tmprss2、tmprss4、nanos1、nanos2、cd163、黑皮质素-4受体(mc4r)、hmga、igf2、hal、rn、mx1、bat2、ehmt2、prdm1、prdm14或esr。另外或另选地，在某些实施方案中，目的靶基因是prlr、nanos2、deadend(dnd)、apaf1、smc2、gart、tfb1m、sirt1、sirt2、lpl、crtc2、six4、ucp2、ucp3、urb1、eva1c、tmem68、tgs1、lyn、xkr4、foxa2、gbp2、gbp5、fgd6、npc1l1、nudcd3、acss1、fchsd2、ppp1r12a、zfp36l2、cspp1、chi3l2、gbp6、ppfibp1、rep15、cyp4f2、tigd2、pyurf、slc10a2、arhgef17、relt、prdm2、kdm5b、plag1、kcna6、ndufa9、akap3、c5h12orf4、rad51ap1、fgf6、ccnd2、csmd3、aqp3、aqp7、hspb8、dcaf8、slc16a3、tigar或zbtb。

10、在本文所公开方法的任何一个和所有实施方案中，基因编辑试剂包括dna编辑系统，例如大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(zfn)、转座子、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)或crispr。在一些实施方案中，基因编辑试剂包含核酸内切酶，例如cas9。在其他实施方案中，基因编辑试剂不包含核酸内切酶。另外或另选地，在一些实施方案中，基因编辑剂包含至少一种与组成型或诱导型启动子可操作连接的grna。基因编辑剂可以以dna、rna或核糖核蛋白(rnp)提供给胚胎干细胞。

11、在多个实施方案中，用于改善陆生或水生动物性状的方法可以包括：(a)将获自陆生或水生动物的胚胎干细胞与有效量的基因编辑试剂接触，以获得包含所需基因编辑的基因编辑的胚胎干细胞；(b)从基因编辑的胚胎干细胞中产生胚胎，其中胚胎的至少一些细胞包含所需的基因编辑。在各种配置中，其中胚胎干细胞可以从非人哺乳动物中获得；并且可以进一步包括：(c)将胚胎植入代孕母体内。在各种配置中，胚胎干细胞可以获自鱼；并且可进一步包括：(c)在适合孵化的条件下培养胚胎。在各种配置中，产生胚胎可包括使(a)中获得的一个或更多个基因编辑的胚胎干细胞与卵母细胞接触。

12、在各种实施方案中，用于建立在陆生或水生动物中具有改进性状的基因编辑细胞系的方法可以包括：(a)将获自陆生牲畜或水生动物的胚胎干细胞与有效量的基因编辑试剂接触，以获得包含所需基因编辑的基因编辑胚胎干细胞；(b)从基因编辑的胚胎干细胞中产生基因编辑的胚胎干细胞系。在各种配置中，该方法还可以包括(c)从一个或更多个基因编辑的胚胎干细胞产生胚胎，该胚胎干细胞系获自(b)中产生的基因编辑的胚胎干细胞系。

13、在各种配置中，胚胎干细胞可以获自牛、猪或鱼。在各种配置中，胚胎干细胞可以获自牛。在各种配置中，胚胎干细胞可以获自猪。在各种配置中，所需的基因编辑可以在anp32、anpep、tmprss2、tmprss4、nanos2、cd163、黑皮质素-4受体(mc4r)、hmga、igf2、hal、mx1、bat2、ehmt2、prdm1、prdm14或esr基因中。在各种构型中，所需的基因编辑可以在prlr、nanos2、deadend(dnd)、apaf1、smc2、gart、tfb1m、sirt1、sirt2、lpl、crtc2、six4、ucp2、ucp3、urb1、eva1c、tmem68、tgs1、lyn、xkr4、foxa2、gbp2、gbp5、fgd6、npc1l1、nudcd3、acss1、fchsd2、ppp1r12a、zfp36l2、cspp1、chi3l2、gbp6、ppfibp1、rep15、cyp4f2、tigd2、pyurf、slc10a2、arhgef17、relt、prdm2、kdm5b、plag1、kcna6、ndufa9、akap3、c5h12orf4、rad51ap1、fgf6、ccnd2、csmd3、aqp3、aqp7、hspb8、dcaf8、slc16a3或tigar基因中。

14、在各种配置中，所需基因编辑可影响包括以下的性状：高海拔适应和对缺氧的反应、冷适应、体型和身材、对疾病和细菌感染的抵抗力、繁殖或生长和饲料效率。在各种配置中，所需基因编辑可影响包括以下的性状：高海拔适应和对缺氧的反应、冷适应、体型和身材、对疾病和细菌感染的抵抗力、繁殖、奶的产量和成分、生长和饲料效率或无角表型。

15、在各种配置中，基因编辑试剂可以包含大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)或至少一种向导rna(grna)。在各种配置中，基因编辑试剂可以包含至少一种grna。在各种配置中，基因编辑试剂还可以包含cas蛋白。在各种构型中，基因编辑试剂还可以包含cas9。在各种构型中，所需基因编辑可以包括缺失、编码取代的氨基酸的核苷酸取代或过早终止密码子。在各种配置中，将胚胎干细胞与基因编辑试剂接触可以包括电穿孔或核转染。

16、本教导可以覆盖通过本教导的任何配置的方法产生的胚胎。本指导可以包括通过本指导的任何配置的方法产生的胚胎干细胞系。在一些构型中，细胞可以在无饲养层的条件下生长。

17、本文还公开了通过本文所公开方法的任何一个和所有实施方案产生的遗传修饰的猪、牛、羊或水生生物。

技术实现思路