一种利用HPLC检测市售奶茶中天然色素胭脂树橙的方法

(一)本发明属于食品添加剂检测，尤其涉及固相萃取-高效液相色谱检测市售奶茶中天然色素胭脂树橙的方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、市售奶茶饮品类乳饮料受到大量年轻消费者的追捧，为迎合消费者的视觉感官体验，一些不法商家可能会擅自添加或超量使用各类着色剂等来改善饮品的色泽。天然色素胭脂树橙(主要为降红木素和红木素)色泽鲜亮，具有很强的着色力，因而受到商家的青睐。对比人工合成色素具有致突变、致畸、甚至致癌等潜在风险的特点，天然色素有着更高的安全性。但如果天然色素超剂量、超范围、无限制的使用，也可能对人体造成危害。

2、目前针对降红木素(norbixin)和红木素(bixin)的检测主要有谷物、肉制品、奶酪以及巧克力类食品基质，奶茶饮料这类新兴食品中对该类色素的检测方法开发尚未见报道。由于奶茶饮品大多以零售店式的规模现场生产和售卖，因此其基质的复杂性以及不确定性给日常监督检测带来严峻的考验。

3、采用国标gb 5009.287-2022《食品安全国家标准食品中胭脂树橙的测定》方法检测食品中胭脂树橙，二氯甲烷液液萃取对样品进行前处理，需要使用大量卤代试剂，毒性大，环境不友好，且操作过程相对繁琐，可能存在净化不彻底，使得高效液相色谱无法准确进行定性和定量检测。

4、现有技术报道食品中胭脂树橙的含量检测过程中将目标物从食品基质中分离出来，有采用液液萃取、quechers净化、或者直接提取上机检测等传统前处理手段，在应对食品中较低含量的降红木素和红木素的检测时常有萃取效率不高、富集净化不彻底等问题，极有可能存在杂质干扰、基质效应等问题，对后续上机检测带来严峻挑战。

5、现有的技术报道检测胭脂树橙有高效液相色谱法(hplc)、超高效液相色谱法、超高效液相色谱配备四级杆-飞行时间串联质谱法，其中文献报道采用hplc法的定量限最低为0.5mg/kg(国标方法的定量限为1.0mg/kg)。虽然目前已有超高效液相色谱配备四级杆-飞行时间串联质谱分别针对降红木素或红木素的检测方法开发(cn201910958000.5和cn201910958368.1)，但因其设备昂贵等原因，对区县级检测机构或中小型食品生产厂家在缺少液质联用仪等高档检测设备时的普适性并不强。

6、为匹配常规液相色谱检测条件下对奶茶饮品中较低含量降红木素和红木素的定性和定量检测，开发一种新型固相萃取方案对提取液进行富集和净化，从而达到高灵敏度和准确度的前处理方法，可作为国家标准的补充，并具有一定的普适性。同时简单易实施的检测方案有助于区县等小城市食品流通市场的监管，维护消费者的权益，并推动天然色素在奶茶饮品中的安全合理使用。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种利用hplc检测市售奶茶中天然色素胭脂树橙的方法，采用三甲胺修饰的对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为填料的新型固相萃取柱，检测市售奶茶中胭脂树橙(主要为降红木素和红木素)，定量限可达到0.1mg/kg，较国标方法中的1.0mg/kg有大幅度的提高，可作为国家标准的补充。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种利用hplc检测市售奶茶中天然色素胭脂树橙的方法，所述方法包括如下步骤：(1)待测样品提取液：取待测奶茶样品，加入ph 9.7-11.5提取剂，振荡提取3-10min(优选5min)，重复提取1-6次，离心(优选8000r/min离心5min)，收集提取液，氮吹浓缩至提取剂相同体积，即为待测样品提取液；所述提取剂是含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)的氨水有机溶液，所述提取剂中bht质量浓度0.1-1％，氨水体积浓度1-10％，有机溶液包括甲醇、乙醇或乙腈；

4、(2)样品净化：以三甲胺修饰的对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物作为固相萃取柱的填料，先用甲醇和水依次活化固相萃取柱，重力自流；然后上样待测样品提取液，重力自流；再依次用水和甲醇淋洗固相萃取柱，重力自流；最后用体积比3：7的乙酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液并氮吹至试管底部无流动液体(即近干)，得到净化样品；将净化样品用含质量浓度0.1％ bht的乙醇溶液溶解，过0.22μm微孔有机滤膜，收集滤液，即为样品待测溶液；

5、(3)hplc检测：步骤(2)样品待测溶液利用高效液相色谱仪进行检测，根据降红木素标准曲线和红木素标准曲线，获得待测样品中降红木素和红木素含量；

6、所述高效液相色谱仪配有pda检测器和dikma diamonsil c18色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；进样量：20μl，柱温：30℃，流动相a：乙腈，流动相b：2％甲酸水溶液，流速：1.0ml/min，检测波长：458nm。

7、进一步，步骤(1)提取剂是在体积浓度5％的氨水乙醇溶液中添加质量浓度0.1％bht。

8、进一步，步骤(1)提取剂体积用量以待测奶茶样品质量计为1-5ml/g，优选1ml/g。所述提取剂中bht质量浓度0.1％，氨水体积浓度5％，有机溶液为乙醇。

9、进一步，步骤(2)活化所用甲醇和水均为0.5-2个(优选1个)柱体积。样品待测溶液上样量为0.5-2个(优选1个)柱体积。淋洗用水和甲醇均为0.5-2个(优选1个)柱体积。洗脱用乙酸甲醇溶液为0.5-2个(优选1个)柱体积。

10、进一步，步骤(2)三甲胺修饰的对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物按如下方法制备：

11、①氮气保护和冰浴条件下，在三口圆底烧瓶中加入乙腈，再依次加入对氯甲基苯乙烯、二乙烯基苯和偶氮二异丁腈，磁力搅拌下加热升温至60℃，保持48h，后自然冷却至室温，过滤，滤渣依次用甲醇、甲苯、丙酮超声洗涤，最后60℃真空干燥12h，得到对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物母体微球；所述二乙烯基苯与对氯甲基苯乙烯和偶氮二异丁腈质量比为1:1-5:0.1-1(优选1:3:0.116)；所述乙腈体积用量以二乙烯基苯质量计为50-200ml/g(优选100ml/g)；

12、②取对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物母体微球，加入1,2-二氯乙烷，在氮气保护下加入三甲胺和三氯化铁，磁力搅拌下80℃保持24h；后冷却至室温，过滤，滤渣依次用甲醇超声洗涤(优选100w、30min)、ph为1.0的硝酸水溶液洗涤至硫氰酸铵检测不变红；再用索氏提取法用丙酮室温提取12h，所得的提取物依次用甲醇、乙醚超声洗涤(优选100w、30min)，60℃真空干燥12h，得到三甲胺修饰的对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物；所述对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物母体微球与三氯化铁质量比为1:0.1-1(优选1:0.4)；所述1,2-二氯乙烷体积用量以对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物母体微球质量计为5-20ml/g(优选10ml/g)；所述三甲胺体积用量以对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物母体微球质量计为5-20ml/g(优选10ml/g)；所述丙酮体积用量以对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物母体微球质量计为5-20ml/g(优选10ml/g)。

13、进一步，步骤(2)填料用甲醇分散后，填装入通过式固相萃取管中，得到固相萃取柱；填料装填量以固相萃取管容积计为120mg/6ml。

14、进一步，步骤(3)流动相a与流动相b体积比70:30进行等度洗脱。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

16、1.本发明在待测样品的提取步骤时针对降红木素和红木素分子结构特点，优化了氨水配合有机溶剂的组成，具体包括有机溶剂的选择和氨水的比例，使得天然色素胭脂树橙(主要为降红木素和红木素)能够完全游离出来，可以更充分地针对基质复杂性以及不确定性的奶茶饮品中提取胭脂树橙，确保更高的提取率以达到减少提取操作次数的目的。并且在提取液中加入一定量抗氧化剂bht，避免了在提取和后续净化过程中降红木素和红木素的氧化，确保检测结果的准确性和稳定性。

17、2、本发明通过采用三甲胺修饰的对氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物作为吸附材料制备固相萃取柱，用于奶茶中胭脂树橙的前处理，可充分去除蛋白质、脂质等基质中的干扰物质，消除样品中基质复杂性所带来的基质效应，从而在节省了检测人员的时间成本的同时，确保降红木素和红木素都具有合适的回收率，提高方法的准确度。

18、3、通过对奶茶样品中的胭脂树橙采用特定的提取和富集净化前处理，可以实现通过常规的高效液相色谱仪做到奶茶饮品这类食品中较低含量降红木素和红木素的定性和定量检测。

19、4、本发明方法在0.50-50.00mg/l浓度范围内，降红木素和红木素的响应峰面积线性关系良好，r2≥0.9997，且在0.50mg/l浓度下两个目标峰的信噪比都大于10。因此可从国标方法的定量限1.0mg/kg提升到本发明的0.1mg/kg进(前处理稀释倍数为0.2)，有效提高了检测方法的灵敏度，基本可以达到现有报道uplc-q-tof/ms检测方案的技术水平，可应用于区县级检测机构或食品生产厂家在缺少液质联用仪等高档检测设备时对奶茶饮品中天然色素胭脂树橙的质量管控，并且该方法具有很好的普适性。本发明很好的解决了区县等小地方对市场中低含量降红木素和红木素的定性和定量检测难题，为保障消费者健康，提升企业自身技术发展水平，促进我国检测技术的发展，带动小摊贩经营业态的发展等具有重要的现实意义。