一种具有抗炎和抗氧化功能的预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒及其制备方法和应用

本发明专利涉及生物医药，更具体地，涉及一种具有抗炎和抗氧化功能的预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、脓毒症是一种复杂的、危及生命的疾病，其特征是宿主对感染的炎症反应不受调节，导致高发病率和死亡率。更准确地说，它是一种系统性炎症反应综合征，表现出免疫过度激活，在危重情况下可能导致“细胞因子风暴”的发生。同时，它往往伴随着氧化应激的失调，活性氧（reactive oxygen species，ros）和活性氮过度产生，导致组织损伤，继而发展为多器官功能障碍综合征。因此，抑制免疫反应的过度激活和改善氧化应激是脓毒症治疗的重要策略。然而，到目前为止，脓毒症干预措施的疗效十分有限，接受治疗的患者的死亡率仍高达50%。虽然研究人员已经针对脓毒症的关键候选药物进行了数百项临床试验，但只有少数药物显示出对脓毒症患者的预后有适度的改善。一个重要的原因是，脓毒症是一个高度复杂的综合征，其发病机制复杂，涉及大量促炎细胞因子（il-1β、il-6、tnf-α、inf-γ等），以及促炎细胞因子和ros之间的相互作用。所以，仅针对一种或几种特定因素的药物或疗法不足以完全治愈该疾病。因此，迫切需要开发能够同步靶向促炎细胞因子和ros的抗炎和抗氧化治疗策略，以有效地治疗脓毒症，改善其预后。

2、另一方面，（coronavirus disease 2019，covid-19）是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2）引起的致命性肺炎，尽管由于sars-cov-2的突变和毒性降低，covid-19的发病率、严重程度和死亡率大幅降低，但它仍有可能引发严重的肺炎甚至死亡。目前，除支持性治疗外，covid-19的主要治疗方法还包括抗病毒药物、免疫调节剂、中和抗体等，但有效性有待进一步提高。与脓毒症和其他炎症性疾病的病理生理过程类似，sars-cov-2诱导的肺炎表现为肺组织中免疫细胞的大量浸润，伴随着各种促炎细胞因子（如il-6、tnf-α和inf-γ）的大量释放和ros的过度积累。考虑到不同促炎细胞因子之间以及促炎细胞因子与ros之间复杂的网络和级联相互作用，这些有害因素的广谱清除可能有助于缓解肺组织的高炎症状态，使covid-19的有效治疗成为可能。

3、此外，皮肤创面的进展还涉及炎症相关反应以及多种促炎细胞因子和ros。由于多种类型的细胞和活性成分的参与，皮肤伤口愈合通常是最复杂的生物过程之一，可分为四个重叠（但定义明确）的阶段：止血、炎症、增殖和重塑。细菌感染等因素往往会引起严重的伤口炎症反应，导致大量促炎细胞因子的分泌（il-1β、il-6，tnf-α）和ros的产生，使伤口愈合时间延长。因此，从伤口微环境中有效、广谱地清除促炎细胞因子和ros，有望加速炎症期向增殖和重塑期的过渡，从而促进伤口快速愈合。

4、中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，pmns）是血液中主要的免疫细胞，占白细胞总量的50~70%。由于pmns的细胞膜上携带多种趋化因子受体（如ccr2和cxcr2）和促炎细胞因子受体（包括il-1r和tnf-αr），所以由pmn膜制备的仿生纳米粒子可以实现精确靶向炎症病灶并广谱中和促炎细胞因子。考虑到血液是临床中最容易获得的样本，并且通过梯度离心从血液中分离pmns也很简单，加上中性粒细胞含量高及其潜在的广谱抗炎特性，利用自体中性粒细胞作为原材料治疗炎症性疾病具有巨大的实际应用潜力。然而，活的pmns具有释放促炎细胞因子和促进炎症浸润的固有倾向，直接应用活的pmns并不能实现广谱的抗炎作用。专利cn 115637254 a公开了一种新型冷冻休克技术制备的中性粒细胞，在实现中性粒细胞死亡（丧失炎性浸润和炎性细胞因子释放功能）的前提下，保留其细胞膜蛋白受体的完整性，从而能够有效吸附和中和多种炎性细胞因子，改善过度炎症造成的组织器官损伤。然而其膜表面促炎细胞因子受体和趋化因子受体含量较低，与促炎细胞因子结合能力有待提高，以提升在可能产生细胞因子风暴疾病（如脓毒症、新型冠状病毒感染）中的治疗效果。另外，如前所述，在脓毒症、新型冠状病毒感染、皮肤创面等疾病的治疗方面，要同时抗炎和抗氧化，才能有效缓解高炎症状态。因此，需要开发一种可以更好地与促炎细胞因子中和、靶向病灶，降低ros水平，同时具有抗炎和抗氧化功能的纳米粒子，以实现对脓毒症、新型冠状病毒感染、皮肤创面等疾病的有效治疗。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种同时具有抗炎和抗氧化功能的预激活冷冻休克中性粒细胞。

2、本发明的第二个目的在于提供所述冷冻休克中性粒细胞的制备方法。

3、本发明的第三个目的在于提供所述冷冻休克中性粒细胞的应用。

4、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

5、本发明首先提供一种同时具有抗炎和抗氧化功能的预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒，所述预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒命名为cat@p-cd-pmns；是以tnf-α预激活的冷冻休克中性粒细胞（p-cd-pmns）为载体，并装载过氧化氢酶（cat）；所述tnf-α预激活的冷冻休克中性粒细胞是以tnf-α预激活处理的中性粒细胞为原料，采用cn 115637254 a中公开的新型冷冻休克技术制备的中性粒细胞。

6、本发明提供的上述纳米粒cat@p-cd-pmns，是以tnf-α预激活的冷冻休克中性粒细胞作为死细胞载体装载过氧化氢酶后得到。冷冻休克中性粒细胞消除了中性粒细胞固有的炎症效应，同时保留了完整的细胞结构、功能受体和药物传递能力，而通过tnf-α预激活中性粒细胞，可使中性粒细胞的细胞表面表达更多的促炎细胞因子受体和趋化因子受体，因此在后续冷冻休克后可以更好地与促炎细胞因子中和、靶向病灶；进一步通过装载过氧化氢酶，使tnf-α预激活的冷冻休克中性粒细胞可以与ros结合，同时发挥抗炎和抗氧化的功能，更加有效地治疗炎症性疾病。

7、本发明还提供所述预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

8、s1.获取中性粒细胞；

9、s2.采用tnf-α刺激中性粒细胞，获得预激活的中性粒细胞；

10、s3.将含预激活的中性粒细胞的冷冻液进行冷冻休克，获得tnf-α预激活的冷冻休克中性粒细胞；

11、s4.将tnf-α预激活的冷冻休克中性粒细胞与过氧化氢酶溶液共孵育，获得装载过氧化氢酶的tnf-α预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒，即所述具有抗炎和抗氧化功能的预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒。

12、进一步地，步骤s2所述tnf-α刺激中性粒细胞为采用重组人tnf-α在36～38℃下刺激中性粒细胞1～3小时。

13、优选地，为采用重组人tnf-α在37℃下刺激中性粒细胞2小时。

14、进一步地，步骤s1获取中性粒细胞为采用中性粒细胞提取试剂盒通过梯度离心分离法获得。

15、优选地，所述中性粒细胞来源于自体细胞成分，原料充足且无免疫排斥风险。

16、进一步地，步骤s3所述冷冻休克为于-75～-85℃预冷15～25 min后再进行液氮冻死，复苏。

17、优选地，步骤s3所述预冷为-80℃预冷20 min。

18、优选地，步骤s3所述液氮冻死为采用液氮浸泡处理6～12小时。

19、进一步，步骤s4所述预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒中氧化氢酶浓度为30μg/细胞。该浓度下，负载效率约为75%，远远高于现有报道的细胞载体。

20、本发明研究表明，在脓毒症的治疗中，上述纳米粒可以靶向炎症病灶、显著降低促炎细胞因子的表达、有效清除几乎所有的ros，充分证明了纳米粒的靶向作用、广谱抗炎作用、抗氧化作用；在新型冠状病毒感染的治疗中，纳米粒可以显著降低肺组织中促炎细胞因子的浓度、显著抑制肺组织内的ros累积、显著降低了covid-19小鼠的死亡率，充分证明了纳米粒的广谱抗炎作用、抗氧化作用以及总体治疗效果；在皮肤创面治疗中，纳米粒可以显著提高了伤口修复率、清除伤口组织中大量ros、显著减轻了组织坏死和炎症浸润，充分证明了纳米粒的促进伤口愈合能力、抗氧化作用、伤口修复作用。

21、本发明提供的tnf-α预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒消除了中性粒细胞固有的炎症效应，同时保留了完整的细胞结构、功能受体和药物传递能力。在小鼠脓毒症、covid-19和皮肤创面模型中，该冷冻休克中性粒细胞通过不同途径精准靶向炎症损伤组织并长期驻留，同时可以广谱中和促炎细胞因子和有效清除活性氧。治疗后，炎症损伤明显减轻，小鼠存活时间延长，伤口愈合迅速。

22、因此本发明还提供上述具有抗炎和抗氧化功能的预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒在制备需要同时进行抗炎和抗氧化治疗的疾病的治疗药物中的应用。

23、进一步地，所述疾病为脓毒症、新型冠状病毒感染或皮肤创面。

24、本发明还提供一种用于抗炎和抗氧化的制剂，含有上述具有抗炎和抗氧化功能的预激活冷冻休克中性粒细胞。

25、进一步地，还包括药学上可接受的辅料。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、本发明提供了一种具有抗炎和抗氧化功能的预激活冷冻休克中性粒细胞纳米粒，是以tnf-α预激活的冷冻休克中性粒细胞作为死细胞载体装载过氧化氢酶后得到。通过tnf-α预激活中性粒细胞，可使中性粒细胞的细胞表面表达更多的促炎细胞因子受体和趋化因子受体，因此在后续冷冻休克后可以更好地与促炎细胞因子中和、靶向病灶；进一步通过装载过氧化氢酶，使tnf-α预激活的冷冻休克中性粒细胞可以与ros结合，同时发挥抗炎和抗氧化的功能，可实现对脓毒症、新型冠状病毒感染、皮肤创面等疾病的有效治疗。