一种提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法及其合成黄酮类化合物的应用与流程

本发明涉及生物,尤其是涉及一种提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法及其合成黄酮类化合物的应用。
背景技术:
1、黄酮类化合物是一类重要的植物的次级代谢产物,是以2-苯基色原酮为母核而衍生的一类化合物,即以c6-c3-c6为基本碳骨架衍生而来。研究表明,黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性,被用于医药或保健品的生产。
2、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,f3h)是黄酮类化合物合成过程中的一个关键酶,属于植物2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-oxo-glutarate dependentdioxygenase,2-odd)家族。f3h可以催化式i所示黄烷酮生成式ii所示二氢黄酮醇:
3、
4、研究表明,不同物种间f3h基因编码的氨基酸序列和蛋白的空间结构都高度保守,含有典型的2-酮戊二酸和亚铁离子的结合结构域。随着合成生物学的发展,已经在大肠杆菌、酿酒酵母等微生物中建立了黄酮类化合物的异源表达途径。
5、然而,在现有的研究中,f3h主要在较低的底物浓度下(约0.2g/l)发挥催化作用,不适合工业化生产的要求。而在较高底物浓度下,该酶显示出明显的底物抑制现象,导致酶的活性明显下降甚至完全消失。因此,需要获得在高浓度底物条件下具有较高催化活性的f3h,以满足工业化生产黄酮类化合物的要求。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题,本发明提供了一种提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法及其合成黄酮类化合物的应用。本发明提供的突变体在高浓度底物的条件下具有较高的催化活性,克服了野生型酶存在的底物抑制的缺点,在黄酮类化合物的生物合成中具有良好的工业化应用前景。
2、本发明的技术方案如下:
3、一、本发明提供了提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法,所述方法是通过对野生型黄烷酮-3-羟化酶的保守序列进行定点突变得到突变体实现的。其中黄烷酮-3-羟化酶(f3h)突变体,是将野生型黄烷酮-3-羟化酶保守序列的关键氨基酸突变得到的。
4、进一步地,所述的野生型黄烷酮-3-羟化酶为seq id no.1所示氨基酸序列,或与seq id no.1所示氨基酸序列具有80%以上序列一致性,且含有保守序列gkkggfivsshl、dwreivtyfsyp、dmdqkvvi/vn、srlsiatfqnpa和myk/rrkmskd。
5、进一步地,所述的f3h突变体在亲本f3h氨基酸序列的保守序列gkkggfivsshl中第三个氨基酸k、保守序列gkkggfivsshl中第七个氨基酸i、保守序列dwreivtyfsyp中第三个氨基酸r、保守序列dmdqkvvi/vn中第五个氨基酸k、保守序列srlsiatfqnpa中第十个氨基酸n、保守序列myk/rrkmskd中第二个氨基酸y这六个氨基酸中至少一处进行突变。
6、优选的,六个氨基酸序列分别突变为a、v、k、e、q和f。
7、二、本发明还提供了所述黄烷酮-3-羟化酶(f3h)突变体在催化黄烷酮合成黄酮类化合物中的应用,即利用黄烷酮-3-羟化酶突变体或表达了黄烷酮-3-羟化酶突变体的重组工程菌进行催化。
8、具体地,所述f3h突变体在催化合成黄酮类化合物的应用方法包含以下步骤:
9、s1、构建表达f3h突变体的重组工程菌。
10、优选的,所述重组工程菌的宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)。
11、s2、含f3h突变体的重组工程菌的培养。
12、进一步地,所述培养过程包括种子液培养和发酵培养阶段。
13、s3、以黄酮类物质为底物,利用f3h突变体催化黄酮类物质得到目的产物。
14、进一步地,所述催化过程可以采用纯化后的f3h突变体酶、含f3h突变体酶的粗酶液或者表达f3h突变体的重组工程菌。
15、进一步地,所述催化过程可以在s2所述发酵培养过程中进行,也可以发酵结束后收集菌体后,再进行催化反应。
16、进一步地,所述催化过程中表达f3h突变体的重组工程菌按湿重添加量为1-50g/l,底物添加量为0.2-10g/l,吐温80添加量为1-15g/l,葡萄糖添加量为5-20g/l,硫酸亚铁添加量为5-50mg/l。
17、进一步地,所述催化过程中反应ph为6.0-8.0,反应温度为25-40℃,反应时间为1-72h。
18、本发明有益的技术效果在于:
19、本发明公开了提高黄烷酮-3-羟化酶的催化活性的方法及其应用,其改善了高浓度底物对酶活性的抑制,使得黄烷酮-3-羟化酶可以在高浓度底物条件下发挥催化作用,这给黄酮类化合物的生物合成带来了极大的便利。
技术特征:
1.一种提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法,其特征在于,所述方法是通过对野生型黄烷酮-3-羟化酶的保守序列进行定点突变得到突变体实现的;
2.权利要求1得到的黄烷酮-3-羟化酶突变体的应用,其特征在于,所述突变体用于催化黄烷酮合成二氢黄酮醇。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述催化过程包含以下步骤:
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤s3所述的黄烷酮-3-羟化酶的加入形式包括纯化后的突变体酶、含黄烷酮-3-羟化酶突变体酶的粗酶液、或者表达黄烷酮-3-羟化酶突变体的重组工程菌。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤s3所述的催化过程中表达黄烷酮-3-羟化酶突变体的重组工程菌按湿重添加量为1-50g/l,底物添加量为0.2-10g/l,吐温80添加量为1-15g/l,葡萄糖添加量为5-20g/l,硫酸亚铁添加量为5-50mg/l。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤s3所述的催化过程中反应ph为6.0-8.0,反应温度为25-40℃,反应时间为1-72h。
技术总结
本分案申请提供了一种提高黄烷酮‑3‑羟化酶催化活性的方法及其合成黄酮类化合物的应用,属于生物技术领域。所述的提高黄烷酮‑3‑羟化酶催化活性的方法是将野生型黄烷酮‑3‑羟化酶的保守序列的关键氨基酸突变得到的。将该突变体酶过量表达后用于催化反应,在高浓度底物的条件下具有较高的催化活性,克服了野生型酶存在的底物抑制的缺点,在黄酮类化合物的生物合成中具有良好的工业化应用前景。
技术研发人员:王金城,焦松,李禾钱,陈秋慧
受保护的技术使用者:杭州佳嘉乐生物技术有限公司
技术研发日:
技术公布日:2024/11/18
技术研发人员:王金城,焦松,李禾钱,陈秋慧
技术所有人:杭州佳嘉乐生物技术有限公司
备 注:该技术已申请专利,仅供学习研究,如用于商业用途,请联系技术所有人。
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