一种提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法及其合成黄酮类化合物的应用与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法及其合成黄酮类化合物的应用。

背景技术：

1、黄酮类化合物是一类重要的植物的次级代谢产物，是以2-苯基色原酮为母核而衍生的一类化合物，即以c6-c3-c6为基本碳骨架衍生而来。研究表明，黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，被用于医药或保健品的生产。

2、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase，f3h)是黄酮类化合物合成过程中的一个关键酶，属于植物2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-oxo-glutarate dependentdioxygenase，2-odd)家族。f3h可以催化式i所示黄烷酮生成式ii所示二氢黄酮醇：

3、

4、研究表明，不同物种间f3h基因编码的氨基酸序列和蛋白的空间结构都高度保守，含有典型的2-酮戊二酸和亚铁离子的结合结构域。随着合成生物学的发展，已经在大肠杆菌、酿酒酵母等微生物中建立了黄酮类化合物的异源表达途径。

5、然而，在现有的研究中，f3h主要在较低的底物浓度下(约0.2g/l)发挥催化作用，不适合工业化生产的要求。而在较高底物浓度下，该酶显示出明显的底物抑制现象，导致酶的活性明显下降甚至完全消失。因此，需要获得在高浓度底物条件下具有较高催化活性的f3h，以满足工业化生产黄酮类化合物的要求。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法及其合成黄酮类化合物的应用。本发明提供的突变体在高浓度底物的条件下具有较高的催化活性，克服了野生型酶存在的底物抑制的缺点，在黄酮类化合物的生物合成中具有良好的工业化应用前景。

2、本发明的技术方案如下：

3、一、本发明提供了提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法，所述方法是通过对野生型黄烷酮-3-羟化酶的保守序列进行定点突变得到突变体实现的。其中黄烷酮-3-羟化酶(f3h)突变体，是将野生型黄烷酮-3-羟化酶保守序列的关键氨基酸突变得到的。

4、进一步地，所述的野生型黄烷酮-3-羟化酶为seq id no.1所示氨基酸序列，或与seq id no.1所示氨基酸序列具有80％以上序列一致性，且含有保守序列gkkggfivsshl、dwreivtyfsyp、dmdqkvvi/vn、srlsiatfqnpa和myk/rrkmskd。

5、进一步地，所述的f3h突变体在亲本f3h氨基酸序列的保守序列gkkggfivsshl中第三个氨基酸k、保守序列gkkggfivsshl中第七个氨基酸i、保守序列dwreivtyfsyp中第三个氨基酸r、保守序列dmdqkvvi/vn中第五个氨基酸k、保守序列srlsiatfqnpa中第十个氨基酸n、保守序列myk/rrkmskd中第二个氨基酸y这六个氨基酸中至少一处进行突变。

6、优选的，六个氨基酸序列分别突变为a、v、k、e、q和f。

7、二、本发明还提供了所述黄烷酮-3-羟化酶(f3h)突变体在催化黄烷酮合成黄酮类化合物中的应用，即利用黄烷酮-3-羟化酶突变体或表达了黄烷酮-3-羟化酶突变体的重组工程菌进行催化。

8、具体地，所述f3h突变体在催化合成黄酮类化合物的应用方法包含以下步骤：

9、s1、构建表达f3h突变体的重组工程菌。

10、优选的，所述重组工程菌的宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)。

11、s2、含f3h突变体的重组工程菌的培养。

12、进一步地，所述培养过程包括种子液培养和发酵培养阶段。

13、s3、以黄酮类物质为底物，利用f3h突变体催化黄酮类物质得到目的产物。

14、进一步地，所述催化过程可以采用纯化后的f3h突变体酶、含f3h突变体酶的粗酶液或者表达f3h突变体的重组工程菌。

15、进一步地，所述催化过程可以在s2所述发酵培养过程中进行，也可以发酵结束后收集菌体后，再进行催化反应。

16、进一步地，所述催化过程中表达f3h突变体的重组工程菌按湿重添加量为1-50g/l，底物添加量为0.2-10g/l，吐温80添加量为1-15g/l，葡萄糖添加量为5-20g/l，硫酸亚铁添加量为5-50mg/l。

17、进一步地，所述催化过程中反应ph为6.0-8.0，反应温度为25-40℃，反应时间为1-72h。

18、本发明有益的技术效果在于：

19、本发明公开了提高黄烷酮-3-羟化酶的催化活性的方法及其应用，其改善了高浓度底物对酶活性的抑制，使得黄烷酮-3-羟化酶可以在高浓度底物条件下发挥催化作用，这给黄酮类化合物的生物合成带来了极大的便利。

1.一种提高黄烷酮-3-羟化酶催化活性的方法，其特征在于，所述方法是通过对野生型黄烷酮-3-羟化酶的保守序列进行定点突变得到突变体实现的；

2.权利要求1得到的黄烷酮-3-羟化酶突变体的应用，其特征在于，所述突变体用于催化黄烷酮合成二氢黄酮醇。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述催化过程包含以下步骤：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤s3所述的黄烷酮-3-羟化酶的加入形式包括纯化后的突变体酶、含黄烷酮-3-羟化酶突变体酶的粗酶液、或者表达黄烷酮-3-羟化酶突变体的重组工程菌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤s3所述的催化过程中表达黄烷酮-3-羟化酶突变体的重组工程菌按湿重添加量为1-50g/l，底物添加量为0.2-10g/l，吐温80添加量为1-15g/l，葡萄糖添加量为5-20g/l，硫酸亚铁添加量为5-50mg/l。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤s3所述的催化过程中反应ph为6.0-8.0，反应温度为25-40℃，反应时间为1-72h。