一种用于生物合成吲哚丙酸的重组载体、工程菌及其应用的制作方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种用于生物合成吲哚丙酸的重组载体、工程菌及其应用。

背景技术：

1、吲哚丙酸(indole propionic acid，ipa)又名吲哚-3-丙酮酸(indole-3-propionic acid，ipa)，是一种肠道微生物衍生的色氨酸脱氨产物，其具有细胞内信号活性。ipa具有维持肠道完整性、改善肠屏障功能、调节免疫及减轻炎症反应等方面的作用，此外，ipa可用作植物生长刺激素和医药中间体，ipa具有生长素生物活性，可被植物的根、茎、叶和花吸收用于促进生根、座果等有望作为新型绿色饲用添加剂开发和应用。

2、目前，ipa的合成方法主要包括化学合成法和微生物发酵法。化学合成ipa的途径主要有3种：(1)以己二酸二乙酯为原料化学合成ipa，该法合成路径长，操作繁琐，产率较低，仅有12.9％；(2)以吲哚和丙烯酸为原料化学合成ipa，该方法相对较为成熟，经两步合成ipa，产率为57.1％-78.3％，但是反应所需试剂meldrum酸的制备非常困难，难以投入实际应用；(3)以吲哚、异恶唑和芳香醛为原料化学合成ipa，过该方法可以将廉价的材料合成ipa，且产率较高，达79％，但该方法存在一定的副产物，分离纯化复杂，成本高。因此化学合成法步骤复杂、成本高、产率低以及环境污染严重，不适合大规模生产，需要开发一种微生物发酵法生产ipa。

3、在人和动物体内，ipa全部是由色氨酸经肠道细菌代谢产生。色氨酸是必需氨基酸之一，主要从食物中获取，小部分由肠道细菌合成。据报道，有2％～4％的色氨酸通过肠道细菌代谢产生色胺、吲哚和多种吲哚衍生物。拥有不同色氨酸代谢酶的肠道细菌能够将色氨酸分解为不同类型的代谢物，且不同细菌的代谢能力存在巨大差异。研究表明，能够独立完成色氨酸代谢并产生ipa的细菌主要来自梭菌属(clostridium)和消化链球菌属(peptostreptococcus)，包括生孢梭菌(c.sporogenes)、肉毒梭菌(c.botulinum)和厌氧消化链球菌(p.anaerobius)。它们主要通过芳香族氨基酸转氨酶(aromatic amino acidaminotransferase，arat)催化色氨酸生成吲哚丙酮酸(indole-3-pyruvic acid，ipya)，ipya再经吲哚乳酸脱氢酶(indolelactate dehydrogenase，ildh)、吲哚乳酸脱水酶(indolelactate dehydratase，ild)和酰基辅酶a脱氢酶(acyl-coa dehydrogenase acd)的催化反应生成ipa。因此，需要开发一种方法简单、无需额外添加催化剂、成本低且能大量合成ipa的载体和工程菌。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种用于生物合成吲哚丙酸的重组载体、工程菌及其应用；本发明利用微生物代谢工程和合成生物学的方法，构建了一种用于合成吲哚丙酸的重组载体，所述重组载体包含邻氨基苯甲酸合成酶基因trped、融合的吲哚-3-甘油磷酸合酶/磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶基因trpc和色氨酸合成酶基因trpba以及苯酰辅酶a脱水酶亚基fldc基因；将所述重组载体转化至e.coli bl21(de3)胞内实现以上四个基因的过表达，获得用于生物合成吲哚丙酸的工程菌，所述工程菌能够稳定大量合成吲哚丙酸，具有广阔的应用前景。

2、为了达到上述技术目的，本发明采用以下技术手段：

3、本发明首先提供了一种用于生物合成吲哚丙酸的重组载体，所述重组载体在表达载体上构建表达了邻氨基苯甲酸合成酶基因trped、融合的吲哚-3-甘油磷酸合酶/磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶基因trpc和色氨酸合成酶基因trpba以及苯酰辅酶a脱水酶亚基基因fldc。

4、优选地，所述表达载体包括载体pet-28a(+)；

5、所述trped、trpc、trpba和fldc核苷酸序列如seq id no.1～4所示。

6、本发明还提供了一种工程菌，所述工程菌包含上述重组载体。

7、优选地，所述工程菌的宿主细菌包括大肠杆菌，优选为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。

8、本发明还提供了上述重组载体、工程菌在生物合成吲哚丙酸中的应用。

9、优选地，所述应用为：以胞内合成的l-色氨酸为前体生物合成吲哚丙酸。

10、本发明还提供了一种生物合成吲哚丙酸的方法，所述方法为：采用上述工程菌发酵生产吲哚丙酸。

11、优选地，所述发酵方法包括：

12、(1)将上述工程菌接种至发酵培养基，加入卡那抗生素进行第一次摇床培养，培养结束后取终浓度1％(v/v)菌液接种至发酵培养基中进行第二次摇床培养；

13、(2)培养一段时间后，向其中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷进行第三次摇床培养，培养结束后转入含葡萄糖的发酵罐中进行发酵，发酵过程中流加葡萄糖定时取样菌液，离心取上清、滤膜过滤，检测吲哚丙酸产量。

14、优选地，步骤(1)中，所述第一次摇床培养和第二次摇床培养的条件为：在37℃、220rpm的条件下培养；所述发酵培养基为液体lb培养基。

15、优选地，步骤(2)中，所述第三次摇床培养的条件为：在30℃、220rpm的条件下培养；

16、所述发酵的条件为：在温度30-37℃、ph 6.0-8.0、通气量0.1-1vvm空气下进行发酵，发酵过程中流加葡萄糖至发酵36-48h时停止流加。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、本发明利用微生物代谢工程和合成生物学的方法，构建了包含邻氨基苯甲酸合成酶基因trped、融合的吲哚-3-甘油磷酸合酶/磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶基因trpc和色氨酸合成酶基因trpba以及苯酰辅酶a脱水酶亚基基因fldc的全新重组载体ipa-pet28a，并将重组载体转入到e.coli bl21(de3)中，构建了工程菌，所述工程菌能够稳定地将胞内合成的l-色氨酸转化为吲哚丙酸，无需外源添加l-色氨酸，实现了以细菌自主合成l-色氨酸为底物的生物合成吲哚丙酸的发酵过程。相比外源添加l-色氨酸，本发明所述方法成本低、可控性高，同时减少外源l-色氨酸对细菌产生的影响。

19、本发明所述包含重组载体的工程菌能够实现将胞内合成l-色氨酸转化为吲哚丙酸，从而大量、稳定地合成吲哚丙酸。利用此工程菌进行5l发酵罐发酵，经发酵条件优化，重组大肠杆菌可生产2.73g/l的吲哚丙酸，具有十分广阔的应用前景。相比之下，现有技术中所述生物合成吲哚丙酸的方法仅可生产52.31mg/l，本发明所述方法吲哚丙酸产量提高了52倍。

20、本发明所述方法以改造微生物为技术基础，利用重组大肠杆菌菌株进行吲哚丙酸的合成，避免了工业上大规模的提取、分离、纯化过程，不需要高温高压等合成条件，也不需要催化剂的使用，不仅对于环境友好，而且容易控制生产成本，具有良好的工业应用前景。