一种利用荧光检测及效靶比评价NK细胞生物学效力的方法与流程

本发明涉及生物医学，尤其涉及一种利用荧光检测及效靶比评价nk细胞生物学效力的方法。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(natura l k i l l er ce l l，nk细胞)，对多种肿瘤细胞或感染细胞有较强杀伤作用。nk细胞与多种疾病的发生、发展及治疗有密切关系，因此，通过对nk细胞的生物学效力评估可以了解不同个体的细胞免疫功能。

2、体外nk细胞生物学效力的评价对其体外、体内在细胞活性、抑瘤效果、免疫治疗等方面的功能研究，具有重要的指导意义。除了在基础研究方面提供参考，也为后续产品开发、临床使用提供必要参考。

3、nk细胞生物学效力的常见检测方法，包括51cr释放实验、乳酸脱氢酶(ldh)释放法、ca l cei n-am/pi法等方法。但这些方法存在局限，如：51cr释放实验，同位素废弃物处理及实验防护要求高；ldh释放法，结果误差较大,重复性较差；ca l cei n-am/pi(碘化丙啶)对一些高核浆比的细胞染色效果不佳，ca l ce-i n-am在高浓度时对细胞功能有不同程度的损伤，且pi具有一定的毒性、致突变性，有安全风险。

4、因此，提供一种方便快速、安全、准确、灵敏的评估方法来评价nk细胞的生物学效力，对nk细胞功能评价、免疫治疗的发展具有积极意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种体nk细胞生物学效力的评价方法。所述方法通过酶标仪的化学发光检测器识别靶细胞k562-luc的荧光变化，可实现简单快速、高灵敏度、高通量地检测nk细胞的生物学效力，并且所需nk细胞样本量少，同时通过不同效靶比的杀伤率反映nk细胞生物学效力，可进一步评价nk细胞对靶细胞的生长抑制、杀伤能力。

2、一种体外自然杀伤细胞生物学效力的评价方法，步骤如下：

3、(1)、室温下分别离心nk细胞、靶细胞k562-luc，离心结束后分别收集细胞后，并用kbm581培养基稀释至细胞密度；

4、(2)、分别计数出活的nk细胞、k562-luc细胞，备用；

5、(3)、将计数后的nk细胞、k562-luc细胞按照效靶比置于孔板的孔中共混培养；其中，效靶比e:t＝10:1、5:1、1:1、0.5:1及0.1:1；

6、(4)、混合培养结束后，往孔板的孔中加入荧光素反应底物，反复吹打混匀后室温避光孵育；

7、(5)、孵育结束后，在酶标仪上选用570nm波长读出荧光检测值；

8、(6)、通过荧光检测值及效靶比来评价nk细胞生物学效力。

9、本发明的nk细胞生物学效力评价方法，通过构建一个可稳定表达荧光素酶的靶细胞，并结合酶标仪的化学发光检测器识别靶细胞k562-luc的荧光变化，实现简单快速、高灵敏度、高通量地检测nk细胞的生物学效力；所需nk细胞样本量少，操作简单，评价成本低；同时，通过不同效靶比的杀伤率反映nk细胞生物学效力，并可进一步用于评价nk细胞对靶细胞的生长抑制、杀伤能力。

1.一种利用荧光检测及效靶比评价nk细胞生物学效力的方法，其特征在于，将k562-luc靶细胞与nk细胞混合培养；培养结束后，加入荧光素反应底物进行孵育；孵育结束，通过检测荧光检测值并结合效靶比来评价nk细胞的生物学效力。

2.根据权利要求1所述的利用荧光检测及效靶比评价nk细胞生物学效力的方法，其特征在于，靶细胞k562-luc细胞与nk效应细胞混合前还需做如下处理：

3.根据权利要求2所述的利用荧光检测及效靶比评价nk细胞生物学效力的方法，其特征在于，nk细胞悬液、k562-luc靶细胞悬液分别加入孔板中时，k562-luc靶细胞密度控制为1000～10000细胞/孔；且设置效靶比为10:1、5:1、1:1、0.5:1及0.1:1。

4.根据权利要求3所述的利用荧光检测及效靶比评价nk细胞生物学效力的方法，其特征在于，nk细胞悬液、k562-luc靶细胞悬液加入孔板中共培养时，每孔中各自终体积分别为50μl。

5.根据权利要求1所述的利用荧光检测及效靶比评价nk细胞生物学效力的方法，其特征在于，荧光素反应底物为gmone-step荧光素酶试剂，且加入量为100μl/孔。

6.根据权利要求1所述的利用荧光检测及效靶比评价nk细胞生物学效力的方法，其特征在于，荧光检测值采用酶标仪选用570nm波长条件下读取获得。

7.根据权利要求1所述的利用荧光检测及效靶比评价nk细胞生物学效力的方法，其特征在于，通过检测荧光检测值来评价nk细胞的生物学效力步骤，还包括如下处理步骤：