用于评估细胞线粒体形态的方法及其系统与流程

本技术涉及用于评估细胞线粒体形态的方法及其系统。

背景技术：

1、线粒体是高度动态的亚细胞细胞器，其在细胞中经历形态变化并调节能量稳态。线粒体形态的动态变化通过融合(接合)和分裂(fission)(分裂(division))的连续循环来表征，并且在疾病进展中的细胞代谢和功能中发挥作用。

2、通常已知分离的细胞的质量对于在下游分析中进行分子生物学测定非常重要。然而，在进行耗时的下游分子生物学工作流程之前，没有简单的测定可用于快速评估细胞分离物中线粒体的形态状态，这通常导致昂贵的测序。可以使用高分辨率显微镜来可视化样品中的细胞线粒体，但是显微镜的聚焦对于此类可视化是有挑战性的，并且有限数量的图像可能不代表分离的细胞的线粒体形态和质量。

3、流式粒子分选系统(例如分选流式细胞仪)用于基于粒子的至少一种测量的特性对流体样品中的粒子进行分选。可以用荧光染料标记粒子或其组分以促进检测，并且可以通过使用光谱不同的荧光染料标记不同的粒子或组分来同时检测多种不同的粒子或组分。在流式粒子分选系统中，粒子(例如结合分析物的珠或流体悬浮液中的单个细胞)在流中通过检测区域，在检测区域中传感器检测包含在待分选的类型的流中的粒子。传感器在检测到待分选的类型的粒子时，触发选择性分离感兴趣粒子的分选机构。

4、使用从所检测的光生成的数据，可以记录组分的分布，并且在需要的地方对材料进行分选。为了分选样品中的粒子，液滴充电机构在流动流的断点处用电荷为包含待分选的粒子类型的流动流的液滴充电。液滴穿过静电场，并且基于液滴上电荷的极性和幅度被偏转到一个或多个收集容器中。不带电荷的液滴不会被静电场偏转。

技术实现思路

1、本公开的各方面包括用于评估细胞线粒体的形态的方法(例如，用于确定样品的细胞的生存力)。根据某些实施方案的方法包括测量来自具有荧光标记的线粒体的样品中的细胞的光，从所测量的光生成细胞线粒体的图像，从细胞线粒体的所生成的图像计算图像参数，以及基于所计算的图像参数来评估细胞线粒体的形态。还描述了用于实践主题方法的系统和集成电路设备(例如现场可编程门阵列)。还提供了非暂时性计算机可读存储介质。

2、在实施方案中，至少基于细胞线粒体的图像参数来评估流动流中的样品中的细胞线粒体的形态。在一些实例中，图像参数是定量图像参数。在一些实例中，基于径向矩图像参数来评估细胞线粒体的形态。在一些实例中，图像参数包括用于染色线粒体的荧光团的径向矩。在一些实例中，径向矩图像参数从基于从细胞线粒体测量的荧光、针对细胞线粒体测量的光损失、针对细胞线粒体测量的前向散射光、针对细胞线粒体测量的侧向散射光及其组合生成的图像计算。

3、在一些实例中，评估形态包括评估细胞线粒体的尺寸。在一些实例中，评估形态包括评估细胞线粒体的点状度。在一些实例中，评估形态包括评估细胞线粒体的形状，例如其中形状可以是球形、纺锤形、椭圆形、细长形和扁平形。

4、在一些实施方案中，线粒体用一种或多种亲脂性阳离子荧光团标记。在一些实例中，线粒体用与线粒体蛋白质形成共价键的荧光团标记。在一些实例中，亲脂性阳离子荧光团具有硫醇反应性部分，用于将荧光团结合到线粒体蛋白质上。在一些实例中，线粒体用与线粒体脂质形成共价键的荧光团标记。在一些实例中，线粒体用对线粒体内膜进行染色的荧光团标记。

5、在一些实施方案中，所计算的图像参数是荧光团的径向矩。在一些实例中，方法包括计算细胞线粒体的所生成图像的像素密度。在一些实例中，通过确定所生成的图像中像素总和来计算图像参数，所述像素总和由每个像素距细胞线粒体的形心的距离加权。在一些实例中，通过将所生成的图像中线粒体的像素的加权和与预定阈值进行比较来评估细胞线粒体的形态。在某些实例中，当所生成的图像中线粒体的像素的加权和等于或超过预定阈值时，确定细胞被活化。在某些实例中，当所生成的图像中线粒体的像素的加权和小于预定阈值时，确定细胞未活化。

6、在一些实施方案中，方法包括基于细胞线粒体的所生成的图像、所计算的图像参数或其组合对细胞进行分类。在一些实例中，对细胞进行分类包括将细胞分配给一个或多个粒子群聚类。在一些实例中，方法包括确定样品的分类细胞的一个或多个分选门。在一些实例中，一个或多个分选门捕获具有目标粒子群聚类的线粒体的细胞，并且排除非目标粒子群聚类的粒子。在一些实例中，目标粒子群聚类包括具有具有预定尺寸的细胞线粒体的细胞。在一些实例中，目标粒子群聚类包括具有细胞线粒体的细胞，所述细胞线粒体表现出等于或大于预定阈值的点状。在一些实例中，非目标粒子群聚类包括具有小于预定阈值的细胞线粒体的细胞。在一些实例中，非目标粒子群聚类包括具有细胞线粒体的细胞，所述细胞线粒体表现出小于预定阈值的点状。在一些实例中，分选门使目标粒子群聚类的细胞的包含产率最大化。在一些实例中，分选门使非目标粒子群聚类的细胞的排除最大化。在一些实例中，方法包括将样品的细胞分选到多个样品容器中。在一些实例中，基于细胞线粒体的所生成的图像对细胞进行分选。在一些实例中，基于所计算的图像参数(例如，线粒体标记的荧光团的径向矩)对细胞进行分选。

7、在一些实施方案中，方法包括用光源照射样品。在一些实例中，样品由光源在流动流中照射。在一些实例中，光源包括一个或多个激光器。在一些实例中，用具有多个光电检测器的光检测系统来检测光。在一些实施方案中，一个或多个光电检测器是光电倍增管。在一些实施方案中，一个或多个光电检测器是光电二极管(例如雪崩光电二极管，apd)。在某些实施方案中，光检测系统包括光电检测器阵列，例如具有多个光电二极管或电荷耦合器件(ccd)的光电检测器阵列。

8、本公开的各方面还包括用于实践主题方法的系统。根据某些实施方案的系统包括：光源，所述光源被配置为照射流动流中具有荧光标记的线粒体的细胞；光检测系统，所述光检测系统包括用于测量来自细胞的光的光检测器和处理器，所述处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器从所测量的光生成细胞线粒体的图像；从细胞线粒体的所生成的图像计算图像参数；以及基于细胞线粒体的所计算的图像参数来评估细胞线粒体的形态。

9、在一些实施方案中，存储器包括计算图像参数的指令，所述图像参数为定量图像参数。在一些实例中，存储器包括用于基于径向矩图像参数来评估细胞线粒体的形态的指令。在一些实例中，存储器包括从基于从细胞线粒体测量的荧光、针对细胞线粒体测量的光损失、针对细胞线粒体测量的前向散射光、针对细胞线粒体测量的侧向散射光及其组合生成的图像来计算图像参数的指令。

10、在一些实施方案中，存储器包括用于通过评估细胞线粒体的尺寸来评估细胞线粒体的形态的指令。在一些实例中，存储器包括用于通过评估细胞线粒体的点状度来评估细胞线粒体的形态的指令。在一些实例中，存储器包括用于通过评估细胞线粒体的形状来评估细胞线粒体的形态的指令。在一些实例中，存储器包括用于确定线粒体的形状是球形、纺锤形、椭圆形、细长形还是扁平形的指令。

11、在一些实施方案中，存储器包括用于计算荧光团的径向矩的指令。在一些实例中，存储器包括用于计算细胞线粒体的所生成的图像的像素密度的指令。在一些实例中，存储器包括用于通过确定所生成的图像中像素总和来计算图像参数的指令，所述像素总和由每个像素距细胞线粒体的形心的距离加权。在一些实例中，存储器包括用于通过将所生成的图像中线粒体的像素的加权和与预定阈值进行比较来评估细胞线粒体的形态的指令。在某些实例中，存储器包括用于当所生成的图像中线粒体的像素的加权和等于或超过预定阈值时确定细胞被活化的指令。在某些实例中，存储器包括用于当所生成的图像中线粒体的像素的加权和小于预定阈值时确定细胞未被活化的指令。

12、在一些实例中，所述存储器包括用于基于细胞线粒体的所生成的图像、所计算的图像参数或其组合对细胞进行分类的指令。在一些实例中，存储器包括用于通过将细胞分配到一个或多个粒子群聚类来对细胞进行分类的指令。在一些实施方案中，存储器包括用于为样品的分类细胞确定一个或多个分选门的指令。在一些实例中，一个或多个分选门捕获具有目标粒子群聚类的线粒体的细胞，并且排除非目标粒子群聚类的粒子。在一些实例中，目标粒子群聚类包括具有具有预定尺寸的细胞线粒体的细胞。在一些实例中，目标粒子群聚类包括具有细胞线粒体的细胞，所述细胞线粒体表现出等于或大于预定阈值的点状。在一些实例中，非目标粒子群聚类包括具有小于预定阈值的细胞线粒体的细胞。在一些实例中，非目标粒子群聚类包括具有细胞线粒体的细胞，所述细胞线粒体表现出小于预定阈值的点状。在一些实例中，存储器包括用于计算使目标粒子群聚类的细胞的包含产率最大化的分选门的指令。在一些实例中，存储器包括用于计算使非目标粒子群聚类的细胞的排除最大化的分选门的指令。

13、在某些实施方案中，系统包括用于显示图形用户界面的显示器。在一些实例中，图形用户界面被配置为用于手动输入一个或多个分选门。在一些实例中，通过在粒子群聚类的散点图上绘制分选门，将分选门手动输入到图形用户界面中。在一些实例中，分选门是超矩形分选门。

14、还描述了具有具有用于评估细胞样品中细胞线粒体的形态的算法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。根据某些实施方案的非暂时性计算机可读存储介质具有用于测量来自包含荧光标记的线粒体的样品中的细胞的光的算法、用于从所测量的光生成细胞线粒体的图像的算法、用于从细胞线粒体的所生成的图像计算图像参数的算法以及用于基于细胞线粒体的所计算的图像参数来评估细胞线粒体的形态的算法。

15、在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于计算图像参数的算法，所述图像参数为定量图像参数。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于径向矩图像参数来评估细胞线粒体的形态的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于从基于从细胞线粒体测量的荧光、针对细胞线粒体测量的光损失、针对细胞线粒体测量的前向散射光、针对细胞线粒体测量的侧向散射光及其组合生成的图像来计算图像参数的算法。

16、在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过评估细胞线粒体的尺寸来评估细胞线粒体的形态的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过评估细胞线粒体的点状度来评估细胞线粒体的形态的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过评估细胞线粒体的形状来评估细胞线粒体的形态的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定线粒体的形状是球形、纺锤形、椭圆形、细长形还是扁平形的算法。

17、在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于计算荧光团的径向矩的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于计算细胞线粒体的生成的图像的像素密度的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过确定生成的图像中的像素总和来计算图像参数的算法，所述像素总和由每个像素距细胞线粒体的形心的距离加权。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过将所生成的图像中线粒体的像素的加权和与预定阈值进行比较来评估细胞线粒体的形态的算法。在某些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于当所生成图像中线粒体的像素的加权和等于或超过预定阈值时确定细胞被活化的算法。在某些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于当所生成的图像中线粒体的像素的加权和小于预定阈值时确定细胞未被活化的算法。

18、在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于细胞线粒体的所生成的图像、所计算的图像参数或其组合对细胞进行分类的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过将细胞分配到一个或多个粒子群聚类来对细胞进行分类的算法。在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于为样品的分类细胞确定一个或多个分选门的算法。在一些实例中，一个或多个分选门捕获具有目标粒子群聚类的线粒体的细胞，并且排除非目标粒子群聚类的粒子。在一些实例中，目标粒子群聚类包括具有具有预定尺寸的细胞线粒体的细胞。在一些实例中，目标粒子群聚类包括具有细胞线粒体的细胞，所述细胞线粒体表现出等于或大于预定阈值的点状。在一些实例中，非目标粒子群聚类包括具有小于预定阈值的细胞线粒体的细胞。在一些实例中，非目标粒子群聚类包括具有细胞线粒体的细胞，所述细胞线粒体表现出小于预定阈值的点状。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于计算使目标粒子群聚类的细胞的包含产率最大化的分选门的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于计算使非目标粒子群聚类的细胞的排除最大化的分选门的算法。