一种海藻酸盐水凝胶包埋大肠菌群进行水质检测的方法与流程

本发明涉及水质检测领域，更具体地涉及一种海藻酸盐水凝胶包埋大肠菌群进行水质检测的方法。

背景技术：

1、大肠杆菌(escherichia coli，简称e.coli)是一类在人类和许多其他温血动物肠道中常见的细菌，通常作为肠道正常菌群的一部分存在，通常对宿主是无害的，甚至在某些情况下是有益的。然而，某些变异株或特定血清型可以引起疾病，如食物中毒、尿路感染、败血症等。这些致病性大肠杆菌可能产生毒素或具有侵入宿主组织的能力。因此对食品和水源中的大肠杆菌进行检测具有重要的公共卫生意义。因为在粪便中普遍存在，大肠杆菌的存在和数量常被用作水质检测的指标微生物，如果水样中检测到大肠杆菌，通常意味着水质可能受到污染。在环境保护领域，大肠杆菌的检测可以评估水体和土壤的环境质量，指导污水处理和环境保护工作。

2、传统培养检测技术(平板培养、mpn法等)操作简单，能够进行定性分析，对于大肠杆菌的鉴定具有较高的准确性。但是所需时间长，通常需要几天才能得出结果，且流程繁琐，不利于快速检测。分子检测技术分析速度快，敏感度高，特异性强。例如，实时荧光定量pcr技术可以实现从定性检测到定量检测的转变，简化了实验流程，减少了污染和误差。但其技术要求高，设备成本昂贵，可能需要专业的操作人员。

3、针对上述现象，已有研究将单重液滴微流控技术与酶促反应和荧光计数法相结合应用于包埋大肠杆菌中。但是大量包埋大肠杆菌的液滴在反应腔室中的单层排列铺开，大肠杆菌在液滴中培养、裂解到检测，这期间需要孵育几个小时，且孵育过程中温度保持在50℃。然而，当两个液滴接触时，它们之间的表面被共同的界面所取代，从而减少了系统的总表面积。由于表面张力的作用，系统趋向于减少表面能，因此两个液滴会自发地融合以降低系统的总能量。另外，温度升高通常会降低液体的粘度和表面张力，使得液滴更容易融合。所以通过改变实验条件减少液滴融合的几率至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种微流控芯片以及一种海藻酸盐水凝胶包埋大肠菌群进行水质检测的方法，从而解决现有水质样品中大肠杆菌的检测技术由于孵育温度升高液滴自发融合导致检测效果不佳的问题。

2、为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

3、根据本发明的第一方面，提供一种微流控芯片，包括：样品入口，油相入口，所述样品入口与一根样品流道连接，所述油相入口通过一分为二的两根油相流道与所述样品流道在一个“十”字口交汇；海藻酸盐水溶液入口，所述海藻酸盐水溶液入口通过一根水相流道与来自所述“十”字口的流道在一个“t”字口交汇；与所述“t”字口连接的液滴混合流道，所述液滴混合流道呈树状结构分叉；与所述液滴混合流道的末端连接的孵育腔室，用于液滴的单层排列；以及出口；其中，所述“t”字口与所述液滴混合流道之间的流道依次设有收缩段流道和第一蛇形流道，分别用于菌液液滴与海藻酸盐液滴在其中的挤压和融合，所述第一蛇形流道相对于收缩段流道具有加宽的流道尺寸。

4、优选地，所述第一蛇形流道与所述收缩段流道的管径比为(1.5～2)∶1。

5、优选地，所述样品入口与所述“十”字口之间通过第二蛇形流道连接。

6、优选地，所述孵育腔室包括：靠近所述液滴混合流道的栅栏，以及分散于所述孵育腔室内的若干支柱。

7、优选地，相邻栅栏之间的通道尺寸为150～200μm。

8、根据本发明的第二方面，提供一种海藻酸盐水凝胶包埋大肠菌群进行水质检测的方法，包括以下步骤：s1：提供一种如上面所述的微流控芯片；

9、s2：向待检测的水质样品中加入除mg2+以外的二价金属盐、pelb复合裂解试剂和酶促反应底物4-cmug以制备得到样品，将所述样品从所述样品入口输入，同时通过油相入口输入油相，使所述样品在“十”字口被油相剪切生成w/o型菌液液滴；s3：海藻酸盐水溶液从海藻酸盐水溶液入口进入，在“t”字口被剪切成w/o型海藻酸盐液滴；s4：通过控制各相的流速使菌液液滴和海藻酸盐液滴一前一后交替向下游流去，接着菌液液滴和海藻酸盐液滴在收缩段流道分别被挤压成长条形液滴，随后在加宽的第一蛇形流道中相邻的一个菌液液滴和一个海藻酸盐液滴变成圆形后融合成一个大液滴，同时发生离子交联形成水凝胶液滴；s5：水凝胶液滴在液滴混合流道中混合均匀，进入孵育腔室并在其中单层排列；s6：40℃孵育3～4h后，大肠杆菌分泌的β-葡萄糖醛酸苷酶催化水解底物4-mug成为特异性荧光物质4-mu，在荧光显微镜下观察并成像，利用泊松分布对发荧光的个数进行计算，即可实现对待检测的水质样品中大肠杆菌的检测。

10、优选地，通过分别调整样品、油相、海藻酸盐水溶液的流速使生成的海藻酸盐液滴尺寸大于菌液液滴尺寸。

11、优选地，通过分别调整样品、油相、海藻酸盐水溶液的流速使生成的海藻酸盐液滴与菌液液滴的直径比为(1～1.5)∶1。

12、优选地，所述除mg2+以外的二价金属盐为cacl2，所述海藻酸盐水溶液是海藻酸钠水溶液。但是应当理解的是，本发明并不仅限于海藻酸钠。另外，本发明的样品制备中所加入的盐也并不仅限于钙盐，还可以是除mg2+以外的其他二价金属盐。

13、优选地，样品中cacl2的浓度为0.1％～0.5％w/w，海藻酸钠水溶液的浓度为0.1～2％w/w。

14、根据本发明，提供了一种在微流控芯片中生成单重液滴并保持稳定的方法。通过海藻酸盐与钙盐溶液相结合，发生离子交联形成水凝胶，原理上来说，海藻酸盐液滴与菌液液滴二者一接触就会发生离子交联反应，形成一个水凝胶液滴，防止液滴进一步融合，通过调节海藻酸盐的浓度还可进一步控制水凝胶液滴的强度大小。小至纳升的液滴可以增加局部荧光物质的体系浓度，超过检测仪器检测限，从而减少检测时间。本发明首次公开这样一种利用海藻酸盐与钙盐发生离子交联的性能，使两种液滴第一次融合之后不会再发生二次融合，保持液滴稳定性的技术方案，在此之前现有技术从未有过类似报道。

15、本发明的关键发明点之一在于，通过分别调整样品、油相、海藻酸盐水溶液的流速，使菌液液滴和海藻酸盐液滴间隔生成，一前一后通过收缩段流道到达加宽的第二蛇形流道，因此相同液滴根本没办法碰到一起，从而保证相邻的一个菌液液滴和一个海藻酸盐液滴变成圆形后融合成一个大液滴，同时发生离子交联形成水凝胶液滴。在此基础上，还可适当降低单个液滴的生成速度，保证液滴融合前不受到后面液滴的干扰。

16、综上所述，根据本发明提供的一种微流控芯片以及一种海藻酸盐水凝胶包埋大肠菌群进行水质检测的方法，通过海藻酸盐与钙盐溶液相结合，发生离子交联形成水凝胶，解决了现有水质样品中大肠杆菌的检测技术由于孵育温度升高液滴自发融合导致检测效果不佳的问题，即使在3～4h的高温孵育过程中液滴也不会发生再次融合，实现了对水质样品中大肠杆菌的精确检测，减少了污染，降低了误差，且操作简单，在水质样品的大肠杆菌检测中具有良好的应用前景。

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一蛇形流道与所述收缩段流道的管径比为(1.5～2)∶1。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述样品入口与所述“十”字口之间通过第二蛇形流道连接。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述孵育腔室包括：靠近所述液滴混合流道的栅栏，以及分散于所述孵育腔室内的若干支柱。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，相邻栅栏之间的通道尺寸为150～200μm。

6.一种海藻酸盐水凝胶包埋大肠菌群进行水质检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过分别调整样品、油相、海藻酸盐水溶液的流速使生成的海藻酸盐液滴尺寸大于菌液液滴尺寸。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过分别调整样品、油相、海藻酸盐水溶液的流速使生成的海藻酸盐液滴与菌液液滴的直径比为(1～1.5)∶1。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述除mg2+以外的二价金属盐为cacl2，所述海藻酸盐水溶液为海藻酸钠水溶液。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，样品中cacl2的浓度为0.1％～0.5％w/w，海藻酸钠水溶液的浓度为0.1～2％w/w。