用于标记生物样本中靶标分子的标记和标记物的制作方法

本发明涉及一种包括纳米结构主链和至少一个染料组的标记(label)，以及一种用于标记生物样本中靶标分子的标记物(marker)，其中染料彼此之间的距离能够实现染料之间的能量转移。

背景技术：

1、为了解决生命科学领域中的关键问题，精确地检测生物样本（例如组织样本或细胞培养物）、环境样本（土壤样本）、水样本、诊断程序（例如在固体活检物或液体活检物或由两者中任一个制备的样本中）或来自此类样本的裂解物或提取物中一种中存在分析物或分子靶标是至关重要的。这可以通过将与特异性结构，（例如特异性生物分子）结合的标记物引入样本中来实现。这些标记物通常包括附着于相关结构的亲和试剂和直接与亲和试剂偶联或通过二级亲和试剂附着于该亲和试剂的具有荧光染料的标记。有多种技术用于分析以这种方式制备的生物样本。

2、荧光显微镜的复用水平，即可同时读出的不同荧光染料的数量通常较低，并且在荧光显微镜的情况下，用于基于通道的读出通常在1至5种染料范围内，以及用于光谱检测器的读出通常在5至12种染料范围内，该光谱检测器使用色散光学元件，诸如与多个检测器或阵列检测器组合的棱镜或光栅。在基于荧光的细胞术和分选（fluorescence-basedcytometry and sorting）中，已经获得略高的复用水平，但在这种情况下，复用受限于较少数量的染料和由此在一次实验中可读出的标记物。

3、“荧光细胞条形码（fluorescent cell barcoding）”是krutzig和nolan于2006年开发的一种多路复用技术，如在nat methods. 2006 may; 3(5): 361-8. doi:10.1038/nmeth872中所描述，其是基于使用三种荧光染料的不同混合物。引自tsai等人于2020年“荧光细胞条形码（fcb）是一种用于高通量流式细胞术（high-throughput flow cytometry,fcm）的多路复用技术。尽管在使染色变化最小化方面非常有效，但由于操作者之间的差异和在数据分析上的差异，其仍然是一种主观的fcm技术”（j immunol methods 2020 feb;477:112667.doi:10.1016/j.jim.2019. 112667. epub 2019 nov 11）。技术的主观性和这种方法的操作者之间的差异两者本质上都与其是基于对染料色调（即强度变化例如浅绿色、绿色、深绿色）中的部分信息进行编码这一事实有关，这严重限制了该技术的使用。

4、稀有细胞，例如成体干细胞、循环肿瘤细胞和反应性免疫细胞（例如对某种抗原有反应的t细胞、b细胞或nk细胞），是基础研究人员和转化研究人员非常感兴趣的。反应性免疫细胞，诸如对某种病原体例如病毒有反应的b细胞克隆，可以产生针对特定病原体的抗体，并且对于生成急需的治疗性抗体具有重要价值。同样，反应性t细胞在个性化医疗背景下以及癌症和其他疾病的治疗中也备受追捧。一旦识别并分离出反应性t细胞，编码对靶标抗原展示亲和力的相应t细胞受体的基因序列就可被克隆，并用于生成基因改造的t细胞，诸如car-t细胞。同样，循环肿瘤细胞有望在诊断癌症、预测疾病结果、管理疗法以及发现新型抗癌药物和基于细胞的疗法方面发挥巨大作用。含有稀有细胞的细胞悬浮液通常源自通过解离获得的组织样本或源自液体活检物。因此，识别、分析和分离这些样本中的稀有细胞，特别是在单细胞水平（single cell analysis, sca）上分析这些细胞，对于基础和转化研究、诊断和治疗应用、以及在生物加工的背景下和在生物制剂和细胞疗法的开发和制造中具有重要价值。

5、随着识别和区分不同细胞类型的能力不断提高，细胞类型的鉴定变得更加精细，即感兴趣的稀有细胞群体会更小且定义更明确。因此，为了找到感兴趣的稀有细胞，通常需要分析大量（<100k）、非常大量（<1m）或超级大量（>1m）的细胞。

6、因此，在不同的荧光读出设备（fluorescent readout devices）如宽场显微镜、共聚焦显微镜、细胞分析仪（cytometers）或荧光激活细胞分选器上快速读出的明亮、光稳定的标记或报告分子或标签是人们所需要的。理想地，这些标记也很小，并且可以通过读出设备可靠地彼此辨别。标记可以建立在各种主链结构上，如gungun lin等人在2018年所综述的，这些主链结构涵盖了广泛的尺寸范围（chem 4, 997-1021, may10, 2018: “the questfor optical multiplexing in bio-discoveries.”）。

7、因此，为了标记和识别大量不同的细胞类型，需要相应的大量标记和相应的标记物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种在用于标记生物样本中靶标分子的标记物中使用的标记，所述标记能够实现区分大量靶标分子。

2、上述目的通过独立权利要求的主题实现。在从属权利要求和以下描述中定义有利的实施方案。

3、在第一方面，提供了一种标记，以用于标记生物样本中靶标分子的标记物中使用。所述标记包括纳米结构主链，包括附着于所述纳米结构主链的第一染料和第二染料的至少一个染料组，其中所述第一染料和所述第二染料在彼此之间的距离（d）内，该距离能够实现所述第一染料与所述第二染料之间的能量转移，以及其中所述染料组中所述染料中的一种染料被配置为在所述能量转移时发射光。在所述染料组中有两种染料的情况下，所述染料组中所述染料中的一种染料可以被配置或被选择为使其作为供体，而所述染料组中的另一种染料（the other dye）可以被配置或被选择为使其作为所述能量转移的受体。所述受体可以被配置为由于所述能量转移而发射光。所述能量转移可以是荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, fret）。与在相同染料的激发波长下直接激发引起的发射相比，当所述发射由所述能量转移引起时，所述染料的光发射的荧光寿命更短。因此，至少可以通过由直接激发引起所述发射还是由所述能量转移引起所述发射来表征所述染料的发射。这能够提供多样化的标记（a diverse set of labels），所述多样化的标记不仅可以通过它们的发射波长，还可以通过它们的荧光寿命或通过取决于所述荧光寿命的测量，区分彼此。相反，这允许区分大量不同的靶标分子。

4、此外，通过根据本发明的所述标记增加了不同标记的数量，其中所述不同标记可以由所述至少两种染料提供。从两种染料可以生成多个可区分的荧光标记，第一，仅具有fret供体（第一）染料的标记，第二，仅具有fret受体（第二）染料的标记，第三，具有所述染料组中两个（第一和第二）染料的标记，其中所述染料的距离足够大，从而不会形成fret对，或者，第四，具有形成所述fret对的所述染料组中两个（第一和第二）染料的所述标记。由于fret导致所述供体的荧光寿命缩短的事实，至少可以通过它们的激发、发射和/或荧光寿命区分所有这些标记，因此可辨别标记的数量始终大于用于生成标记的染料的数量，只要在多种染料中可以找到允许它们之间进行能量转移的至少一个染料组。

5、优选地，所述第一染料与所述第二染料之间的所述距离（d）在1 nm至10 nm之间的范围内。这使得所述染料组中染料之间能够进行特别有效的能量转移。

6、优选地，所述纳米结构主链包括核酸。例如，所述纳米结构主链可以包括dna、rna和/或lna。特别地，所述纳米结构主链由寡核苷酸形式的核酸组成。这使得所述主链的合成和组装容易且可重复。

7、在特别优选的实施方案中，所述纳米结构主链是dna折纸结构。dna折纸可以被设计为提供具有特定预定形状的自组装纳米结构主链。这使得所述主链的合成和组装容易且可重复。

8、优选地，所述dna折纸结构包括至少一个支架链和多个订书钉链（staplestrands），其中所述订书钉链与至少部分的所述支架链互补，并且被配置为将所述支架链带入预定构象。特别地，所述链是寡核苷酸。这使得所述主链的合成和组装容易且可重复，特别是以各种预定形状。

9、为了制造这样的基于dna折纸的结构，通过所谓的订书钉链在精确识别的位置折叠较长的dna分子（支架链）。所述dna折纸可以被设计为提供特定预定形状的自组装纳米结构主链。这使得所述主链的合成和组装容易且可重复。

10、优选地，所述纳米结构主链的最大空间范围在1 nm至10000 nm的范围内，优选地在5 nm至500 nm的范围内。这使得能够容易引入到所述生物样本中。

11、在优选的实施方案中，所述纳米结构主链具有线性形状、平面形状或多面体形状。这使得所述标记的使用特别灵活。特别地，可以选择所述纳米结构主链的形状，以特定地影响附着于所述主链的染料的荧光性质。除了附着于所述纳米结构主链的染料之外（其可用于光学识别相应的标记或所述标记物），如果在相同生物样本或实验中应用具有包括不同形状的所述纳米结构主链的标记的标记物，所述染料附着到的所述纳米结构主链的所述形状相应地也可用作光学鉴定。只要有足够的染料附着于所述相应纳米结构主链下，也可以确定所述纳米结构主链的所述形状，例如以便区分线性与圆形纳米结构主链的所述形状。

12、优选地，所述第一染料和所述第二染料附着于所述订书钉链中的一个订书钉链上。特别地，所述染料在预定位置附着于所述相同订书钉链。订书钉链使得在所述dna折纸上其相应位置对所述dna折纸进行空间上精确的功能化。这使得染料在所述纳米结构主链上能够精确且可预测的定位。

13、如上所述，订书钉链可以是位置选择性功能化的。在这种情况下，位置分辨率受限于在纳米或以下范围内的核苷酸大小。现有技术已利用这一点来生成荧光标准，其中荧光染料连接到dna折纸上精确定位的带。这些标准被称为“纳米尺”，并用于校准成像系统如共聚焦或超分辨率显微镜（例如sted），例如如us2014/0057805 a1所公开的。

14、优选地，所述染料与所述纳米结构主链共价结合，或者每种染料都包括特异性寡核苷酸，并且所述纳米结构主链包括互补的寡核苷酸，每个互补的寡核苷酸都被配置为与所述染料的特异性寡核苷酸中的一个杂交。因此，每种染料都具有特异性寡核苷酸以结合到所述纳米结构主链的相应的或互补的特异性部分。所述互补的寡核苷酸可以是所述纳米结构主链（优选地，所述订书钉链）的一部分，特别是当所述纳米结构主链包括所述核酸时。这使得所述染料能够容易地附着于所述纳米结构主链。所述染料与所述纳米结构主链的所述附着也可以被称为接头（linker）。

15、因此，所述dna折纸为所述染料提供支架。优选地，所述dna折纸结构包括至少一个支架链和多个订书钉链，其中所述订书钉链与至少部分的所述支架链互补，并被配置为将所述支架链带入预定构象。特别地，所述链是寡核苷酸。这使得能够生成具有预定二维或三维形状的、可以自组装的纳米结构主链。此外，这使得能够在所述主链上位点特异性放置染料。优选地，所述染料可以在预定位置附着于所述纳米结构主链的订书钉链。订书钉链允许在所述dna折纸上的其相应位置对所述dna折纸进行空间上精确的功能化。因此，可以沿着所述纳米结构主链、在特定订书钉链或紧密相邻的一组订书钉链处定位所述每种染料。由于所述订书钉链位于预定位置，所以所述染料的所述位置也可以同样预先确定。

16、将所述染料直接附着或连接到所述订书钉链的其他实施例，其介导了与所述纳米结构主链的选择性附着，包括通过例如点击化学反应（例如叠氮化物-炔烃）或通过诸如生物素-链霉亲和素的高亲和力相互作用的直接化学偶联。在后者情况下，可以使用生物素化的订书钉链和链霉亲和素偶联的染料。

17、在优选的实施方案中，所述染料组中所述染料中的一种染料被配置为发射发射光，以响应于用激发光激发所述染料组中的另一种染料(the other dye)。所述染料中的所述一种染料的发射是由来自所述另一种染料的能量转移引起。

18、优选的是所述第一染料和/或所述第二染料是荧光团。

19、优选地，所述第一染料和所述第二染料具有不同的激发波长和/或发射波长。这使得能够在光学上区分所述第一染料与所述第二染料。

20、优选地，根据相应荧光发射是由所述染料的特定激发波长的激发引起的还是由来自所述染料组中所述另一种染料的能量转移引起的，所述染料组中所述染料中的一种染料的荧光寿命不同。特别地，当所述发射是由所述能量转移引起时，所述染料中的特定一种的荧光寿命较短。因此，可以通过至少两个参数，荧光发射波长和荧光寿命表征所述染料的发射。特别地，仅通过不同的荧光寿命就可以将由所述能量转移引起的所述染料的发射与所述激发波长的激发引起的所述相同染料的发射区分。

21、在优选的实施方案中，所述标记包括多个染料组。这使得能够提供具有特别明亮荧光的标记。

22、在优选的实施方案中，至少所述染料组还包括另一种染料（a further dye），所述染料组包括所述第一染料和所述第二染料，其中所述第一染料和/或所述第二染料中的至少一种在所述另一种染料的距离d’内，所述距离能够实现所述第一染料或所述第二染料与所述另一种染料之间的能量转移。特别优选的是，所述距离d’在1至10 nm的范围内。在该实施方案中，所述能量转移可以在所述第一染料激发时发生在所述第一染料与所述第二染料之间，并随后发生在所述第二染料与所述另一种染料之间。特别地，在所述第一染料与所述第二染料之间的所述距离小于使得所述第一染料与所述第二染料之间进行所述能量转移的距离，并且在所述第二染料与所述另一种染料之间的所述距离小于使得所述第二染料与所述另一种染料之间进行所述能量转移的距离，并且在所述第一染料与另一种所述染料之间的所述距离大于使得所述第一染料与所述另一种染料之间进行所述能量转移的距离时，所述另一种染料只有在所述能量转移时发射发射光。这使得能够提供具有不同光学性质的标记。

23、优选地，所述标记还包括至少另一个染料组，所述至少另一个染料组包括第三染料和第四染料或者具有分别不同于所述第一染料、所述第二染料、所述第三染料和/或所述第四染料的特征的至少两种其他染料。特别优选的是，所述另一组的染料具有与所述染料组的染料不同的激发波长和/或发射波长。这使得能够提供具有不同光学性质的标记。当需要区分大量标记时，这尤其有益。

24、优选地，所述染料组和所述另一个染料组彼此间隔开的距离在5 nm至5000 nm的范围内，优选地在10 nm至500 nm的范围内，更优选地在10至50 nm的范围内，最优选地在10至20 nm的范围内。特别地，所述染料组与所述另一个染料组具有一定的距离，使得所述染料组的染料与所述另一个染料组的染料之间的相互作用、例如猝灭或能量转移被降低至最小或被阻止。

25、优选地，所述亲和试剂是抗体、抗体片段、寡核苷酸、适体、肽、药物或毒素中的一种。

26、所述标记物具有与上文描述的所述标记相同的优点。特别地，可以使用针对所述标记的从属权利要求的特征，补充所述标记物。

27、本发明的其他特征和优点来自于权利要求和参考附图进行描述的以下优选实施方案的描述。

28、术语

29、在本文件中，下列术语的使用方式如下：

30、“样本”：在本文件中，“样本”是指“生物样本”，其也可以被称为生物标本，包括例如血液、血清、血浆、组织、体液（例如淋巴液、唾液、精液、间质液、脑脊液）、粪便、固体活检物、液体活检物、外植体、整个胚胎（例如斑马鱼、果蝇）、整个模型生物（例如斑马鱼幼虫、果蝇胚胎、秀丽隐杆线虫（c. elegans））、细胞（例如原核生物、真核生物、古生菌）、多细胞生物（例如团藻（volvox））、悬浮细胞培养物、单层细胞培养物、3d细胞培养物（例如球状体（spheroids）、类肿瘤（tumoroids）、源自各种器官如肠、脑、心、肝脏等的类器官）、任何上述的裂解物、病毒。在本文件中，“样本”还指围绕生物样本的体积。例如在研究分泌蛋白如生长因子、细胞外基质成分的测试中，围绕细胞的、依赖于测试的一定距离的细胞外环境，也被称为“样本”。具体而言，亲和试剂被带入该周围体积在本文件中被称为“被引入样本”。

31、“亲和试剂”：在本文件中，术语“亲和试剂”可以特别地指抗体、单域抗体（也称为纳米抗体）、至少两种单域抗体的组合、适体、寡核苷酸、吗啉基（morpholino）、与预定rna互补的pna、dna靶标序列、配体（例如药物或类药物分子）或毒素（例如一种与肌动蛋白丝结合的毒素，鬼笔环肽（phalloidin））。在本文件中，亲和试剂被配置为以一定的亲和力和特异性结合至靶标分子或分析物，由此可以被认为，亲和试剂对于靶标分子或预定靶标结构基本上具有特异性。在本文件中，“多种亲和试剂”包含亲和试剂，其被配置为特异性地结合至生物样本内的预定靶标结构或预定化学化合物或预定化学元素或分析物。所述多种亲和试剂中的至少一些亲和试剂“被引入样本”，使得所述亲和试剂可以附着于样本内相应的预定靶标结构。在此上下文中和在本文件中以及如上所述，“被引入样本”可以指被物理地引入样本体积中或样本周围的体积和分配到样本的体积中。后者情况的示例可以是例如用于分泌分子的测试，该分泌分子在细胞外空间中进行最好的评估，它们可能在样本之外，但在样本的某个空间环境或附近范围内。

32、“预定的靶标结构”、“靶标”、“分析物”：在本文件中，“预定的靶标结构”是指靶标分子或靶标结构或分析物，其可以是例如蛋白质（例如特定蛋白质）、rna序列（例如某个基因的mrna）、肽（例如生长激素抑制素）、dna序列（例如基因座或元件）、代谢物（例如乳酸）、激素（例如雌二醇）、神经递质（例如多巴胺）、维生素（例如钴胺素）、微量营养素（例如生物素）、金属离子（例如金属和重金属离子，如cd(ii)、co(ii)、pb(ii)、hg(ii)、u(vi)）。

33、“染料”：在本文件中，术语“荧光染料”、“荧光团”、“荧色物”、“染料”可互换使用，以表示荧光化学化合物或结构，并且可以特别是以下其中一种：荧光有机染料、荧光量子点、荧光二联体、荧光碳点、石墨烯量子点或其他碳基荧光纳米结构、荧光蛋白、基于荧光dna折纸的纳米结构。在有机荧光染料中，术语“荧光染料”特别指以下的衍生物：氧杂蒽（例如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、texas）、菁（例如菁、吲哚碳菁（indocarbocyanine）、氧杂碳菁（oxacarbocyanine）、硫代碳菁（thiacarbocyanine）、部花菁）、衍生物、方酸轮烷衍生物（squaraine rotaxane derivatives）、萘、香豆素、恶二唑、蒽（蒽醌、draq5、draq7、cytrak橙）、芘（级联蓝）、恶嗪（尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、恶嗪170）、吖啶（原黄素、吖啶橙、吖啶黄）、arylmethine（金胺、结晶紫、孔雀绿）、四吡咯（卟吩、酞菁、胆红素），dipyrromethene（bodipy、aza-bodipy）、磷光染料或发光染料。以下商标群组指定了可能包括属于不同化学家族的染料的市售荧光染料：cf染料（biotium）、draq和cytrak探针（biostatus）、bodipy（invitrogen）、everfluor（setareh biotech）、alexa fluor（invitrogen）、bella fluore（setareh biotech）、dylight fluor（thermo scientific）、atto和tracy（sigma-aldrich）、fluoprobes（interchim）、abberior染料（abberior dyes）、dy和megastokes染料（dyomics）、sulfo cy染料（cyandye）、hilyte fluor（anaspec）、seta、setau和square染料（seta biomedicals）、quasar和cal fluor染料（biosearch technologies）、surelight染料（columbia biosciences）、vio染料（milteny biotec）(列表修改自：https://en.wikipedia.org/wiki/fluorophore)。在荧光蛋白的组中，特别是绿色荧光蛋白（gfp）家族的成员，包括gfp和gfp样蛋白（例如dsred、tagrfp）及其（单体化）衍生物（例如ebfp、ecfp、eyfp、cerulaen、mturquoise2、yfp、eyfp、mcitrine、venus、ypet、superfolder gfp、mcherry、mplum）在本文件中是指术语“荧光染料”。此外，在荧光蛋白的组中，术语“荧光染料”在本文件中可以包括荧光蛋白，其吸光度或发射特征在结合配体时发生变化，例如bfpms1，或响应于环境变化而发生变化，例如氧化还原敏感的rogfp或ph敏感的变体。此外，在荧光蛋白的组中，术语“荧光染料”在本文件中可以包括蓝藻藻胆蛋白的的衍生物小超红色荧光蛋白smurfp以及可以衍生自smurfp的荧光蛋白纳米颗粒。荧光蛋白的概述可以在rodriguez等人于2017年在trends biochem sci. 2017 feb; 42(2): 111-129中找到。术语“荧光染料”在本文件中还可以指荧光量子点。术语“荧光染料”在本文件中还可以指荧光碳点、荧光石墨烯量子点、荧光碳基纳米结构，如yan等人于2019年在microchimica acta(2019) 186: 583以及iravani和varma 于2020年在environ chem lett. 2020 mar 10:1-25中所描述的。术语“荧光染料”在本文件中还可以指荧光聚合物点（pdot）或纳米金刚石。术语“荧光染料”在本文件中还可以指荧光二联体，例如kacenauskaite et al. 2021j. am. chem. soc. 2021, 143, 1377-1385中所述的perylene antenna和triangeliumemitter的二联体。

34、术语“荧光染料”在本文件中还可以指有机染料、二联体、量子点、聚合物点、石墨烯点、碳基纳米结构、基于dna折纸的纳米结构、纳米尺、掺有染料的聚合物珠、荧光蛋白、无机荧光染料、smile（小分子离子隔离晶格）或填充有上述任何的微胶囊。

35、“标记物”：在本文件中，“标记物”用于表示用作标记物的单个分子和用作标记物的相同分子的集合两者。“标记物”在本文件中是指被配置为附着于预定结构的亲和试剂的组合，该预定结构也被称为靶标分子或分析物和/或“标记”，其可以直接或间接地通过一个或多个“接头”与亲和试剂偶联。

36、“标记”：在本文件中，术语标记表示主链或支撑纳米结构、至少一种染料（优选地至少一种荧光染料）的组装体。所述标记可以具有其他功能化以使得所述标记与亲和试剂连接，从而形成可以用于标记分析物的标记物。

37、“接头”：在本文件中，接头表示将荧光染料组合连接到亲和试剂的不能分割的化学结构（例如单体分子或聚合物）或多部分化学结构组装体。接头可以直接地或共价偶联至染料和亲和试剂，或者间接地通过例如亲和标签-亲和配体组合诸如链霉亲和素-生物素相互作用或例如半抗原或寡核苷酸。在共价偶联的情况下这可以是位点选择性偶联。常用的偶联化学试剂诸如nhs-、马来酰亚胺、叠氮化物-炔烃，以及一系列另外的所谓点击化学试剂可用于将接头与亲和试剂和/或将接头与染料偶联。接头可以特别地包括寡核苷酸（例如dna、rna、lna、pna、吗啉基、其他人工寡核苷酸）、肽、基于dna折纸的结构诸如例如纳米尺、微/纳米珠、聚合物、微/纳米胶囊、微/纳米晶体、碳管、碳基纳米结构（例如石墨烯）。

38、接头可以特别地包括寡核苷酸和前面提到的组中的另一元件，例如包括寡核苷酸和肽。

39、“读出装置”：在本文件中，“读出装置”是指用于执行荧光多色读取或成像的装置。读出装置通常包括至少一个激发光源、包括至少一个检测通道的检测系统，并且还可以包含滤光器和/或色散光学元件（诸如棱镜和/或光栅），以用于将激发光照射至样本和/或将来自样本的发射光照射到检测器上或照射到检测器的适当区域上。所述检测系统在本文件中可以包括几个检测通道，可以是并行检测光谱的多个波段的光谱检测器，或检测光谱的连续部分的高光谱检测器。所述检测系统包括至少一个检测器，其可以是点检测器（例如光电倍增管、雪崩二极管、混合检测器）、阵列检测器、照相机、高光谱照相机。所述检测系统可以记录每个通道的强度，如在细胞分析仪中常见的情况，或者可以是记录图像的成像检测系统，如在平板读数器或显微镜中的情况。具有一个检测器通道的读出装置，例如照相机或光电倍增管，可以使用例如不同的激发和发射波段生成具有多个检测通道的读出。读出装置允许在给定的运行中分析来自给定生物样本的一定数量的染料。“运行”可以指“迭代（iteration）”或“轮次(round)”，即，针对一组给定的染料组合和给定的亲和试剂到染料组合的映射产生至少一个读出，其中所述亲和试剂附着于分析物。该数量通常取决于检测通道数n，所述读出装置被配置为提供，即能够进行光谱解析。在显微镜的情况下，在基于照相机的宽场检测（例如宽场荧光显微镜、转盘式显微镜（spinning disk microscopes）、光片荧光显微镜）的情况下，检测通道数通常为4至5个，而在利用通常依赖于激发或发射指纹和（光谱/线性）非混合的光谱检测概念的显微镜的情况下，5至12个检测通道数。相反，高光谱成像，其可以通过在宽而连续的光谱范围上提供非常精细的光谱分辨率，区分大量染料，但是尚未在显微镜中广泛采用。除了光谱性质外，荧光染料的寿命也可用于辨别多种染料种类，并将它们与自发荧光区分开，从而有效地增加检测通道数，该检测通道数也可对应于一组（即可被相同激发光激发）中可以被可靠分离的染料的最大数量。

40、“寡核苷酸”：在本文件中是指dna、rna、肽、核酸、吗啉基或锁定核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、己糖醇核酸或其他形式的人工核酸。

41、“点”：在本文件中是指样本中或样本周围的区域中正在被读出的体积。点的大小和形状由用于获取数据的成像系统的有效点扩展函数决定。

42、“点扩展函数”：在本文件中，术语“点扩展函数”用于表示点扩展函数的主要最大值，并且除非另有说明，该术语是指成像系统的有效点扩展函数（point spread function，psf），其通常是椭圆形的，即横向分辨率优于轴向分辨率，但由于优选地从等距角获取的视图更多，可能接近球形。

43、“读出”：在本文件中，术语“读出”是指基于图像的读出，其可以在显微镜（如点扫描共聚焦显微镜）或基于照相机/宽场成像系统（例如转盘式显微镜、光片荧光显微镜、光场显微镜、立体显微镜）上获得。此外，术语“读出”是指非基于图像的读出，例如在具有至少一个点检测器或线检测器的细胞分析仪或基于流通式的读出装置（flow-through basedreadout device）中。读出可以由离散读出组成，例如单次获取的发射光谱或图像堆栈，读出可以是读出数据流，例如基本上是连续的点扫描共聚焦或细胞分析仪中。此外，读出可以是一系列的图像，例如光谱或高光谱图像堆栈，其中在每个图像中都记录不同波段的荧光发射。

44、“读出体积”：在本文件中，术语“读出体积”是指由光学系统诸如显微镜或细胞分析仪在给定时刻有效检测到的体积。对于具有连续数据流的系统，所述“读出体积”是由时钟如“像素时钟”确定，其将连续数据流划分为块（chunk），然后将块分配到某个时间点或空间位置。所述读出体积可以取决于成像系统的有效点扩展函数，例如有效点扩展函数可以定义或限制读出体积的最大范围。所述有效点扩展函数取决于所述成像系统的照明和检测点扩展函数，例如，可以基本上类似于点扫描共聚焦显微镜的情况，或者基本上不同于照明显微镜的选择平面的情况。