一种Omicron分型的Sanger测序引物组合和检测试剂盒的制作方法

本申请涉及生物信息学领域，具体涉及一种sanger测序引物组和试剂盒，更具体涉及一种omicron分型的sanger测序引物组合和检测试剂盒，本申请还提供一种omicron毒株分型的方法。

背景技术：

1、新型冠状病毒(sars-cov-2)是冠状病毒科的一种单链rna病毒，病毒的基因组全长约30kb，由编码多种非结构、结构和辅蛋白的基因组成。由于新冠病毒是为rna病毒，其在复制的过程中相较与dna更容易发生突变，以奥密克戎(omicron)为例，其包括的亚型超过了700种，这种突变就可能导致蛋白质的功能及其病毒传播和发病的机制发生改变，进而在临床的表型和治疗及其预后上有较大的差异，因此如何高效快速进行分型对临床和科学研究具有重大意义。

2、目前，市面上已经有大量的专门针对新冠病毒设计的试剂盒，利用这些试剂盒结合二代测序同样可以得到高质量的新冠分型结果。然而这种方法需要专门进行实验提取、建库、测序、分析等步骤，耗费了较多的人力物力。

3、二代测序的mngs技术，检测成本高，且需要每个菌种检测reads度达到3000以上才能鉴别出分型，灵敏度不够。ngs的tngs技术，虽然能够鉴别出分型，但由于ngs技术对样本的投入量要求高，检测成本高，难以负荷大规模检测量，不适用于在临床上大范围普及。qrt-pcr是一种常用的检测新型冠状病毒的技术，使用双靶标特异性检测，该技术高特异性、高灵敏度、检测成本低、耗时短，可以实时监测扩增产物，但该技术仅能通过荧光信号判定病毒是否存在，不能确定病毒分型，且易发生交叉污染，容易出现假阳性。sanger测序技术是最早出现的一种能够准确测定dna序列的技术之一，但是奥密克戎变异位点多，分型需要设计多种引物，进行多次扩增和测序，导致丧失相对于ngs技术的成本优势，现有技术仅将其用于判断受试者是否为阳性，不用于奥密克戎的分型。

技术实现思路

1、本申请提出了一种引物组合，由seq id no：1-14所表示的引物组成。

2、作为优选，所述引物组合中，seq id no：1-14所表示的每种引物具有相同的物质的量占比。

3、本申请进一步提供一种试剂盒，其具有根据权利要求1或2所述的引物组合。

4、作为优选，试剂盒中所述引物形成三组引物组合物，第一引物组合物，由seq idno：1-6的引物组成；第二引物组合物，由seq id no：7-10的引物组成；第三引物组合物，由seq id no：10-14的引物组成。

5、所述试剂盒还具有液化试剂、提取试剂、逆转录试剂、扩增试剂和sanger测序试剂。所述各种试剂可以直接使用市售的各种试剂盒，或自行配制。

6、本申请还提供一种omicron毒株分型的方法，使用本申请所述的引物组合或试剂盒对单链cdna模板进行pcr扩增和sanger测序，将测序结果与omicron毒株的序列进行比对，确定cdna模板对应的omicron毒株的分型。

7、所述omicron毒株选自：ba.5.2，bf.7，ba.5.2.1，ba.5/ba.5.1，ba.2.2.1，ba.5.9，bn.1.3/bn.1.2/bn.1.3.1，bq.1，ba.5.2.16，ba.5.2.24，xbb.1，bq.1.1，ch.1.1，ba.2.3.20，ba.5.2.6，bn.1.5，bf.5，bq.1.1.18和be.1.1亚型。

8、以上毒株中，使用本申请的引物组合、试剂盒仅能确定病毒是否为ba.5/ba.5.1，而无法区分具体为两种亚型中的哪一种；同样，使用本申请的引物组合、试剂盒仅能确定病毒是否为bn.1.3/bn.1.2/bn.1.3.1，而无法区分具体为三种亚型中的哪一种。

9、作为优选，所述sanger测序进行3管扩增，每管投入的引物分别为seq id no：1-6的引物，seq id no：7-10的引物和seq id no：10-14的引物。

10、作为另一种优选，进行所述sanger测序时，对seq id no：1-2、5-6和13-14仅测定f单端，对seq id no:3-4仅测定r单端，对seq id no：7-12测定fr双端。

11、本申请还提供所述引物组合或试剂盒在omicron毒株分型中的应用。

12、本申请所称的“引物组合”仅是多种引物的统称，并不意味着在制造、存储、运输过程中已经将其混合；本申请所称的“引物组合物”指将多种引物混合形成的组合物，其中可以含有各种溶剂或不含有溶剂。所称的“第一引物组合物”、“第二引物组合物”、“第三引物组合物”中的数字仅为作区分之用，不表示对特征的任何限制。

13、本申请所称的“第一容器”、“第二容器”、“第三容器”，表示其内部的空间彼此隔离，并非意味着三个容器必须为物理上彼此独立的。例如，可以设置具有三个独立密封空间的容器，分别用于盛放第一、第二和第三引物组合，该容器仍然符合本申请对“第一容器”、“第二容器”、“第三容器”的描述。

14、本申请主要针对使用sanger测序检测新型冠状病毒常见分型，其中针对目前流行的“omicron”的22种常见亚型设计了7对引物，通过引物的设计及其组合的调整实现3管合并扩增反应完成对7对引物的扩增，覆盖区域包括n蛋白区、s蛋白区、m蛋白区及orf区域的nsp特定区域，共42个氨基酸位点。本申请通过调整引物比例和pcr体系实现合并引物进行合并扩增，并且根据分型区域的大小设计单端或者双端sanger测序，在保证检测准确性的同时极大程度降低试剂成本及人力成本，按照当前试剂价格，考虑仪器折旧和和人工成本，使用mngs法成本约500元，tngs法成本约280元，本申请方法仅需140元。

15、本申请可为临床精准诊疗、科研探索、流行病学调查赋能，同时根据病毒宏基因组的变异特征，分析病毒进化的特有变异位点、变异规律、传播模式等，为病毒溯源、确定病毒传播链等提供理论依据。

1.一种引物组合，其特征在于，由seq id no：1-14所表示的引物组成。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合中，seq id no：1-14所表示的每种引物具有相同的物质的量占比。

3.一种试剂盒，其特征在于，具有根据权利要求1或2所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物形成三组引物组合物，

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还具有液化试剂、提取试剂、逆转录试剂、扩增试剂和sanger测序试剂。

6.一种omicron毒株分型的方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的引物组合，或权利要求3-5中任一项所述的试剂盒对单链cdna模板进行pcr扩增和sanger测序，将测序结果与omicron毒株的序列进行比对，确定cdna模板对应的omicron毒株的分型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述omicron毒株选自：ba.5.2，bf.7，ba.5.2.1，ba.5/ba.5.1，ba.2.2.1，ba.5.9，bn.1.3/bn.1.2/bn.1.3.1，bq.1，ba.5.2.16，ba.5.2.24，xbb.1，bq.1.1，ch.1.1，ba.2.3.20，ba.5.2.6，bn.1.5，bf.5，bq.1.1.18和be.1.1。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述sanger测序进行3管扩增，每管投入的引物分别为seq id no：1-6的引物，seq idno：7-10的引物和seq id no：10-14的引物。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进行所述sanger测序时，对seq id no：1-2、5-6和13-14仅测定f单端，对seq id no:3-4仅测定r单端，对seq id no：7-12测定fr双端。

10.根据权利要求1或2所述的引物组合或根据权利要求3-5中任一项的试剂盒在omicron毒株分型中的应用。