丁型肝炎病毒全基因型双重荧光定量PCR检测试剂

本发明属于丁型肝炎病毒检测，具体涉及一种丁型肝炎病毒全基因型双重荧光定量pcr检测试剂。

背景技术：

1、丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus,hdv)合并乙型肝炎病毒(hepatitis bvirus,hbv)感染会导致最严重的病毒性肝炎并在很大程度上加快肝病进程，研究发现，hdv感染的病患一般在5-10年内就会发展为肝硬化和肝癌，相比而言，临床上hbv单感染患者以及hcv感染患者一般需要15-25年左右才会发展为肝硬化和肝癌。

2、hdv有8种基因型，其中ⅲ型和其他基因型亲缘关系较远，研究发现，在临床上，hdv的基因型与临床症状相关联，主要表现在，ⅲ型容易造成暴发性肝炎，ⅱ型和ⅳ型临床症状较轻，ⅰ型和ⅴ型病死率高。

3、丁型肝炎病毒在全球范围内广泛传播，预估全世界约有1500万人感染hdv，根据模型预测，中国是hdv感染人数最多的国家，国际指南建议对慢性hbv患者进行hdv临床筛查，但是一方面由于hdv rna极易发生变异，导致尚无标准化的检测技术应用于临床，另一方面，国际上推荐使用抗体检测的酶联免疫吸附实验作为临床上检测hdv抗体的手段，但目前市面上使用的试剂盒质量参差不齐，常常导致结果不准确，所以，血液中hdv rna的检出是目前确认感染hdv的“金标准”，再者，目前开发的基于荧光定量pcr检测方法大部分是针对hdvⅰ型，无法做到八种基因型的全面检出，这些原因都在一定程度上导致我国在hdv流行率方面数据匮乏，感染人数被严重低估，间接导致我国hdv的防控形势十分严峻。

4、传统的血清学检测方法灵敏度低，耗时长，成本高，且不能分辨基因型，尤其是不能快速灵敏甄别容易造成暴发性肝炎的丁型肝炎病毒ⅲ型，因此传统方法不适合用于大规模临床使用。多重荧光定量pcr检测技术能很好的规避血清学检测的弱点，灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单，能快速得出结果，且能做到hdv基因型的全面检出，方便对症用药，提高临床治愈的效果，与此同时，有助于研究人员精准掌握我国hdv的流行情况，为我国hdv的防控提供有力依据。

技术实现思路

1、针对现有丁型肝炎病毒检测的不足，本发明提供了一种利用双重实时荧光定量pcr全面检测丁型肝炎病毒八种基因型的检测试剂，以解决现有技术难以做到完全检测丁型肝炎病毒全基因型的难题。

2、为实现以上目的，本发明针对丁型肝炎病毒ⅰ型～ⅷ型的高度保守序列设计了特异性的引物和探针，其中针对丁型肝炎病毒ⅰ型、ⅱ型、ⅳ～ⅷ型的特异性引物为hdv124～8f：cggy aatggcgaatgggac、hdv124～8r：gggtcggcatggcatctc，探针为hdv124～8p：ctccttcggatgcccaggtcgg；

3、针对丁型肝炎病毒ⅲ型的特异性引物为hdv3f：gttcgggaaaagggggactc和hd v3r：ggatgacgacgaaagagaaagaag，探针为hdg3p：tgtgaacccaatggacg gccc。

4、本发明检测试剂还包括用于双重荧光定量pcr检测的其他常规试剂。

5、使用上述双重荧光定量pcr检测试剂的方法如下：

6、1、收集肝病门诊中乙型肝炎病毒阳性临床患者全血样本于抗凝管中，采样时核对患者信息并记录，登记入册，运输过程低温保藏，后置于-80℃保存；

7、2、用天根病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取血液中丁型肝炎病毒基因组rna；

8、3、以步骤2中提取的rna为模板，采用针对丁型肝炎病毒八种基因型的特异性引物和探针，按照反应程序和反应体系进行多重荧光定量pcr检测，根据cq值进行结果判定；其中反应程序为42℃逆转录5min，95℃预变性30sec，95℃变性5sec，62℃退火延伸30sec，39个循环；在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。

9、检测结果判读包括如下内容：(1)扩增曲线呈标准“s”型，且曲线应该平滑，没有明显的锯齿状或平台期；阈值线应该位于扩增曲线的指数增长期，且应该在曲线的中部，不应过高或过低；阴性对照组、无模板对照组无cq值；复孔间重复性良好，如不符合须再次进行多重荧光定量pcr检测，或重新提取核酸进行多重荧光定量pcr检测；(2)病原体ct值≤35.0为阳性。

10、本发明相较于以往的检测方法具有以下优势：

11、本发明可以在一个pcr体系中实现丁型肝炎病毒八种基因型的全面检出，弥补了国际上只能针对丁型肝炎病毒ⅰ型的不足，覆盖的基因型更广，且相较于用八套引物探针的荧光定量方法更加节约成本和快速；

12、本发明的检测方法针对临床样本中出现的乙型肝炎病毒(hbv)dna、丙型肝炎病毒(hcv)rna、戊型肝炎病毒(hev)dna以及登革病毒(denv)rna均不扩增，表明该方法的特异性强；该方法的检测灵敏度均能达到100copies/μl，表明该方法具有高灵敏性；对该方法的批次间和批次内重复性进行评估发现，该方法的批次间和批次内变异系数(cv％)均小于2.0％，表明该方法的重复性和再现性良好。

13、本发明的检测试剂具有高灵敏性、强特异性、重复性和再现性良好、检测快速、成本低廉等特点，对临床上快速诊断，对症用药具有极大价值。

1.一种丁型肝炎病毒全基因型双重荧光定量pcr检测试剂，其特征在于：包括针对丁型肝炎病毒ⅰ型～ⅷ型的特异性引物和探针；